[发明专利]基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体及其制备方法和应用

权利要求书

1.基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，其特征在于，在内部包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体表面结合有抗SM22α单克隆抗体，所述ANT1重组真核表达载体中含有核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因。

2.根据权利要求1所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，其特征在于，所述ANT1重组真核表达载体是将ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的多克隆位点中而得到。

3.根据权利要求1或2所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体，其特征在于，所述脂质体是以质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇为原料制得。

4.权利要求1所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a．ANT1重组真核表达载体的制备：将核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的ANT1基因插入真核表达载体p3xFLAG-CMV-14的多克隆位点中，制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1；

b．ANT1重组真核表达载体的脂质体包封：将卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声，再加入p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器，用核酸酶Dnase I和exonuclease III降解未包封入脂质体的p3xFLAG-CMV-14/ANT1，再用琼脂糖凝胶柱分离除去被核酸酶降解的p3xFLAG- CMV-14/ANT1，即制得包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体；

c．包封有ANT1重组真核表达载体的脂质体与抗SM22α单克隆抗体的连接：将抗SM22α单克隆抗体经巯基化修饰后，与包封有p3xFLAG-CMV-14/ANT1的脂质体在室温下振摇连接过夜，再用琼脂糖凝胶柱分离除去未连接的抗SM22α单克隆抗体，即得基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体。

5.根据权利要求4所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a是将大鼠VSMC总RNA逆转录为cDNA，再以该cDNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3所示的上、下游引物进行PCR扩增，所得PCR产物经纯化后，用NotI和XbaI双酶切，再与同样经NotI和XbaI双酶切的真核表达载体p3xFLAG-CMV-14在T4 DNA连接酶的作用下连接，即制得ANT1重组真核表达载体p3xFLAG-CMV-14/ANT1。

6.根据权利要求5所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤a中PCR扩增的条件为：95℃预变性10分钟，然后94℃变性1分钟、58℃退火1分钟、72℃延伸4分钟，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。

7.根据权利要求4所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体的制备方法，其特征在于，所述步骤b是将质量比为5:1的卵磷脂和胆固醇溶解于乙醚中，减压蒸馏除去有机溶剂，水浴超声5分钟，再加入浓度为0.5mg/mL的p3xFLAG-CMV-14/ANT1溶液，p3xFLAG-CMV-14/ANT1与胆固醇的质量比为1:40，在干冰和42℃水浴中反复冻融并通过孔径为100nm的薄膜挤出器。

8.权利要求1至3任一项所述的基于ANT1基因的靶向型免疫脂质体在制备抗血管狭窄药物中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述抗血管狭窄药物为能够诱导血管平滑肌细胞凋亡并抑制其增殖的药物。