[发明专利]一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及其利用

说明书

本申请是公开号CN 101805744A申请的分案申请，原申请的申请日：2009.09.09，申请号：200910018647.6，发明名称：一种甜菜碱合成途径中的甲基转移酶基因及其修饰和利用。 

技术领域

本发明公开一种蓝细菌甘氨酸甜菜碱合成途径中的两种甲基转移酶基因序列以及其修饰基因的序列和它们分别编码的蛋白质序列，并将这两种基因用于作物抗逆育种，属于基因工程领域。具体地说涉及到克隆和修饰参与一条甘氨酸甜菜碱生物合成途径中的甘氨酸肌氨酸N-甲基转移酶基因和二甲基甘氨酸N-甲基转移酶基因及利用。 

背景技术

在甜菜碱天然合成植物中，甘氨酸甜菜碱作为一种渗透保护物质，能够提高植物对多种非生物胁迫(如盐碱、干旱、低温等)的抗性，而且对某一胁迫的抗性程度与甜菜碱的积累水平密切相关。基因工程研究表明，通过转基因技术在植物中积累甘氨酸甜菜碱能够提高其抗逆性。 

在自然界中，已知的甘氨酸甜菜碱的生物合成途径主要有两种，即胆碱氧化途径和甘氨酸甲基化途径。 

胆碱氧化途径以胆碱为底物，通过一步或两步氧化反应合成甘氨酸甜菜碱。此途径分布广泛，由存在于微生物、植物和哺乳动物中的胆碱脱氢酶(CDH)和甜菜碱醛脱氢酶催化。存在于微生物中的胆碱氧化酶，能催化合成甜菜碱的两个连续的反应。在合成甘氨酸甜菜碱的高等植物中胆碱单加氧酶和甜菜碱醛脱氢酶依次催化甘氨酸甜菜碱合成。已有多个参与胆碱氧化合成甘氨酸甜菜碱的酶基因被相继克隆。 

甘氨酸甲基化途径是甘氨酸经过连续三步N-甲基化生成甜菜碱，是由依赖S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甘氨酸肌氨酸甲基转移酶(glycine sarcosine methyltransferase，GSMT)和依赖SAM的肌氨酸二甲基甘氨酸甲基转移酶(sarcosine dimethylglycine methyltransferase，SDMT)分别催化完成的。从上个世纪80年代后期开始，陆续在一些古细菌、真细菌和极端兰细菌中发现了该条途径，但了解极少，至今只从少数几个物种中克隆得到相关基因。 

以胆碱为底物的合成途径已在多种生物中进行了研究。该途径中根据胆碱氧化方式的不同涉及一种或两种酶。在高等植物中，甜菜碱生物合成途径的研究主要集中于藜科植物，在苋科和禾本科植物中也有研究(McNeil et al.，1999，2001)。在藜科和苋科植物中，甜菜碱由胆碱经两步氧化反应合成，先由胆碱单加氧酶(CMO)催化生成甜菜碱醛，后者在甜菜碱醛脱氢酶(BADH)催化下生成甜菜碱(Weretilnyk et al.，1989；Akamoto，2000)。目前，CMO仅在藜科和苋科植物中发现，推测其它科植物可能具有不同的胆碱氧化酶。而编码BADH的基因已经从菠菜(Weretilnyk and Hanson，1990)等多种植物中克隆。BADH并不是甘氨酸甜菜碱合成特用的酶，它与ω-氨基醛脱氢酶(一种在多胺代谢中广泛存在的酶)相同( et al.，1994；Rathinasabapathi et al.，1994)。 

在大肠杆菌中，与甜菜碱合成相关基因由bet操纵子编码(Andresen et al.，1988；Lamark et al.，1991)：betA编码CDH，betB编码BADH，betT编码胆碱转运蛋白，betI编码调控蛋白，从胆碱到甜菜碱的转变途径与植物中类似，是由两种酶催化的，即胆碱脱氢酶(choline dehydrogenase，CDH)和BADH。CDH是一种依赖氧的膜结合黄素蛋白，不但能催化胆碱氧化为甜菜碱醛，而且能以几乎相同的速率催化甜菜碱醛的氧化。BADH是一种依赖于NAD的可溶性蛋白，对甜菜碱醛具有很高的亲合性(Landfald and Strom， 1986)。 

在微生物球形节杆菌(Arthrobacter globiformis)和滋养节杆菌(A.pascens)中，甘氨酸甜菜碱的合成仅需要一种酶即胆碱氧化酶(choline oxidase，COD)催化(Ikuta et al.，1977)，同时产生H₂O₂。