[发明专利]一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备方法

说明书

技术领域  本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种提高M2型丙酮酸激酶免疫效果的蛋白制备及抗体筛选的方法。

背景技术  近年来肿瘤生物学技术的进展，发现许多新型的肿瘤诊断生物标志物。M2型丙酮酸脱氢酶激酶(PKM2)是目前肿瘤研究领域最为热门的一个肿瘤生物标志物，它作为肿瘤细胞糖酵解代谢通路的关键酶，与肿瘤发生发展密切相关。它在正常组织中仅表达于肌肉和快速增生组织，在肿瘤组织显著高表达，是许多肿瘤细胞共性的特征。丙酮酸激酶有四种亚型：PKM1、PKM2、PKL及PKR。PKM1主要表达于分化成熟的组织如肌肉和神经组织，PKM2主要表达于快速增生的细胞，如胚胎干细胞、正常快速增生细胞及肿瘤细胞等，PKL主要表达于肝脏、肾脏及结肠，PKR表达于红细胞中。

结肠癌中PKM2的高表达，常随着肿瘤细胞的脱落，可在粪便中被检测到，因此可作为结肠癌的诊断生物标志物。以往对结肠癌的筛查和诊断，常通过粪便中的隐血试验，然而隐血试验由于取样的误差及饮食因素影响等，常导致较高的假阳性率和假阴性率。近几年的临床研究发现，粪便中的PKM2检测可显著提高结肠癌的诊断准确率，灵敏度达80％，特异性达92％，因此将成为今后结肠癌的筛查和诊断的重要生物标志物。血液中PKM2的表达增加，提示有肿瘤的发生，如乳腺癌、肺癌、胰腺癌等。此外，尿液中的PKM2增加，提示患有肾癌，这是第一个有希望作为肾癌的肿瘤生物标志物。综上所述，PKM2是一个重要的肿瘤生物标志物，粪便中的PKM2检测可帮助诊断结肠癌等胃肠道肿瘤，尿液中PKM2的检测可辅助诊断肾癌，血液中PKM2的检测可辅助诊断乳腺癌及肺癌等。

目前PKM2的检测试剂盒仅德国的ScheBo·Biotech AG公司有生产相关诊断产品，主要有用于结肠癌筛选的检测试剂盒及血清中PKM2的检测试剂盒，其产品“免疫层析法快速检测试剂盒”能在数分钟内检测粪便中的PKM2含量，现已用于各医院的临床检测。此产品由于价格比较昂贵，若进口到国内在医院中使用，其昂贵的价格普通病人难以承受，因此也不便在人群中推广。其它如Abcam等科研试剂公司提供的PKM2抗体，仅限于科研使用，价格昂贵，且无亲和力、特异性和灵敏度较高的抗体用于临床检测。因此，我国必须开发具有自主知识产权的PKM2检测试剂盒，降低试剂盒的成本，以便能在国内进行推广和普及，使结肠癌等肿瘤能够早期发现早期治疗，提高肿瘤治疗的有效率，能够服务于人民群众的健康事业。目前，PKM2的检测试剂盒的开发主要有两种方法：一是常用的酶联免疫法(ELISA)检测试剂盒，二是基于免疫层析法的快速检测试剂盒。其相关产品均可用于临床的检测。因此，本申请的研究也开发两种诊断试剂盒，分别为常规的酶联免疫法检测试剂盒和胶体金免疫层析法的快速检测试剂盒。两种类型的检测试剂盒，从价格和便利性方面满足临床上不同的实际需求。

由于PKM2仅在氨基酸序列的389-433位与PKM1存在差异(见说明书附图2)，因此需取这部分氨基酸进行作为抗原。而这特异的45个氨基酸序列，由于其片段较小，因此免疫原性较差。本申请的研究策略是将45个氨基酸的抗原序列连接在带有GST标签的pET24a载体上，促进蛋白的正确折叠，提供蛋白的得率及纯化，同时有利于提高抗体的免疫原性，并且可作为初步的抗体筛选所用。在抗体的筛选阶段，合成不同表位的肽段，用于筛选特异性和亲和力高的抗体，用于后续的试剂盒开发。这样的一种针对M2型丙酮酸激酶(PKM2)免疫效果的蛋白制备方法，即克服了蛋白免疫原性差的弱点，也有利于目的蛋白的获取和后续抗体的筛选，因此鉴于以上的技术背景，提出本发明方法。

发明内容  本发明的目的就是提供一种能简便、高效地进行PKM2蛋白在原核系统中的制备工艺。该发明使得PKM2蛋白的免疫原性增强，增加了抗PKM2蛋白抗体的多样性。该发明简单易行，适用于低分子量蛋白的表达、纯化和抗体制备。同时，本发明合成PKM2的多种独特的多肽序列，用于高特异性和高亲和力抗体的筛选，减少非特异性抗体，提高抗体的筛选效率。

本发明的内容主要由两部分组成：

1.构建pET24a-GST-PKM2-A的重组蛋白，用于动物的抗原免疫。本申请使用的pET24a载体，已经构建有带有GST的标签。PKM2-A片段的序列为：IYHLQLFEELRRLAPITSDPTEATAVGAVEASFKCCS GAIIVLTK。特异序列见说明书附图1。