[发明专利]一种酵母菌落PCR菌体前处理的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种酵母的菌落PCR菌体前处理方法。

背景技术

长久以来，酿酒酵母、裂殖酵母等做为理想生理生化功能研究的模式生物，一直被科学家们关注着。随着合成生物学的蓬勃发展，常规酵母又以其独有的代谢途径、简便的遗传操作方法突显出它的优势。这些研究的基础是对酵母进行遗传改造，即通过表达外源基因或者敲除内源基因来实现。而遗传改造后繁琐的鉴定过程大大阻碍了研究的进程。传统的鉴定一般是通过提取基因组来进行鉴定的。通常根据酵母的生长周期(100-300min)，需要1-3天的时间以积累足够的菌体来提取基因组。提取的一般步骤可以概括为：先用玻璃珠破碎或者酶法降解细胞壁，再利用有机溶剂进行抽提，最后用乙醇沉淀DNA(Amberg，D.C.，D.J.Burke，and J.N.Strathern.，J.N.(2005)Methods in Yeast Genetics：A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual.2005 ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY.)。这个过程通常为2-6h不等，操作繁琐。并且一些试剂，如酚、氯仿等会对操作者的身体健康产生危害。

菌落PCR是一种不需要提取基因组DNA，直接采用菌体处理以后的样品作为模板，进行基因鉴定的方法。其操作简便，快捷，省时少力，并且极少使用有毒试剂。目前许多针对酵母的菌落PCR的方法仅能扩增获得多拷贝、短片段的ITS(internal transcribed spacer)序列(Luo，G.，and Mitchell，T.G.(2002)Rapid identification of pathogenic fungi directly from cμltures by using mμltiplex PCR，J Clin Microbiol 40，2860-2865；Mirhendi，H.，Diba，K.，Rezaei，A.，Jalalizand，N.，Hosseinpur，L.，and Khodadadi，H.(2007)Colony-PCR is a rapid and sensitive method for DNA amplification in yeasts，Iran J Public Health 36，40-44；Borman，A.M.，Linton，C.J.，Oliver，D.，Palmer，M.D.，Szekely，A.，and Johnson，E.M.(2010)Rapid Molecμlar Identification of Pathogenic Yeasts by Pyrosequencing Analysis of 35 Nucleotides of Internal Transcribed Spacer 2，J Clin Microbiol 48，3648-3653.专利申请号：CN101851684 A；CN 102230010 A)，无法满足普通分子生物学中鉴定特异基因的要求。一些科学家也发展了基于酵母单拷贝基因鉴定的菌落PCR方法。Mingfu Ling等人报道了(Ling，M.F.，Merante，F.，and Robinson，B.H.(1995)A rapid and reliable DNA preparation method for screening a large number of yeast clones by polymerase chain reaction，Nucleic Acids Res 23，4924-4925.)利用酵母裂解酶zymolyase对酿酒酵母的细胞壁进行降解，然后采用裂解液直接进行菌落PCR反应，可以扩增获得5kb以上的单拷贝基因片段。Marko等人(Looke，M.，Kristjuhan，K.，and Kristjuhan，A.(2011)Extraction of genomic DNA from yeasts for PCR-based applications，Biotechniques 50，325-328.)利用LiOAc结合SDS发展出一种小量快速提取酵母基因组的方法，并应用于酵母的菌落PCR上。以上的报道大部分在子囊菌中，且主要是在模式生物——酿酒酵母中实现的，未见在担子菌上的应用。最近Kuang Hung Liu等(Liu，K.H.，Yeh，Y.L.，and Shen，W.C.(2011)Fast preparation of fungal DNA for PCR screening，J Microbiol Methods 85，170-172.)利用植物细胞破壁试剂结合热处理，对一种担子菌新隐球酵母菌落进行破壁，然后直接用于PCR反应。至今为止，对担子菌的菌落PCR方法仍很少见，没有一种对担子菌和子囊菌普遍适用的方法。总的来说，由于酵母遗传性质的差异和细胞壁结构的复杂性，尚有许多酵母菌株无法通过现有报道的方法，通过菌落PCR的方法进行单拷贝、长片段基因的鉴定。