[发明专利]一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种人工合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用，特别涉及一种根据玉米偏好密码子设计并合成的耐草甘膦基因表达载体及其应用。

背景技术

目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如Bt、EPSPS等，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，如1)AT含量较高，超过60％，造成基因表达的mRNA在植物体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5’-UTR序列和3’末端的polyA加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001％或者几乎检测不到。美国Monsanto公司的Perlak(Perlak F J，Fuchs R L，Dean D A，et al.Modification of the coding SEQ ID NO.uence enhances plant expressing of insect control protein genes.Proc Natl Acad Sci USA，1991，88：3324-3328)和Iannacone等(Iannacoe R，Grieco P D，Cellini F.Specific SEQ ID NO.uence modification of a cry3B endotoxin gene result in high levels of expression and insect resistance.Plant Mol Biol，1997，34：485-496)在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，分别对杀虫蛋白基因和cryIII基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加GC含量，并去除原序列中存在的polyA和富含AT的ATTTA序列等不稳定元件序列，使转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，高达可溶性蛋白的0.02～1％，获得了明显的抗虫效果。

杂草是农作物生产的大害，自1942年出现近代杂草防治技术以来，化学除草剂有了很大的发展。草甘膦类除草剂是一种广谱性、非选择性除草剂，它通过抑制EPSPS(5-烯醇丙酮酰草酸-3-磷酸合酶，是植物体内芳香族氨基酸合成途径中的一个重要酶)的活性，阻断了植物莽草酸途径的生物合成，强烈抑制细胞分裂，对许多一年生和多年生杂草都具有强烈的抑制作用。由于草甘膦易于被微生物分解，在土壤中无残毒，对动物无毒害，自从1976年Roundup研制成功以来，得到了广泛的应用。

但是，由于玉米等禾本科作物对草甘膦敏感，使其应用受到限制。因此，将耐草甘膦基因转入玉米，不但可以扩大草甘膦的使用范围，而且可降低生产成本，保护玉米免受药害，最终达到增产增收的目的。尽管耐草甘膦基因G2-aroA已在2004年被发现，并在宿主荧光假单胞菌G2及大肠杆菌中都能高效表达，表现高耐草甘膦的特性(Yichen Sun，Min Lin and Yiping Wang.Novel AroA with high tolerance to Glyposate，encoded by a gene of Pseudomonas putida 4G-1 isolated from an extremelypolluted environment in China.Aplied and environmental microbiology.2005，71(8)：4771-4776)，但其在植物，特别是重要的粮食作物中由于表达量较低而没有被利用，因此急需对其在植物中的应用进行研究，如进行密码子优化，以加速其应用到农业生产中。

发明内容

本发明的目的是提供一种表达载体。

本发明所提供的表达载体为表达人工合成的耐草甘膦基因的表达载体；所述人工合成的耐草甘膦基因(命名为mG2-aroA)为下述a)或b)的DNA分子：

a)核苷酸序列为序列表中序列2；

b)核苷酸序列与序列表中序列2至少具有98％的同一性，且编码序列9所示的蛋白质(命名为G2-aroA蛋白)。