[发明专利]一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及了一种荧光纳米银簇探针检测microRNA的分析方法，属于检测分析领域。

背景技术

microRNA是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约18～25个核苷酸。它参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等。近期研究发现，microRNA在肿瘤发生过程中起至关重要的作用，已成为一类理想的肿瘤标记物。所以定量检测microRNA对了解其生物功能，癌症的早期诊断以及新药的开发，都具有十分重要的意义。与传统的核酸检测相比，microRNA其独有的特点，如序列短，家族序列同源性高及低丰度表达，增加了其检测的难度。目前检测microRNA的方法主要有Northern印迹分析，微阵列芯片技术，聚合酶链式反应(PCR)等。虽然Northern印迹是当前microRNA分析的标准方法，但操作繁琐，耗时长，灵敏度低，分析检测时需要大量的样品及分离富集步骤，而且对污染非常敏感，实验中每一步操作不当都会影响分析结果。微阵列芯片技术虽然可实现高通量，多组分同时检测，但是其制作和检测费用高；芯片上可利用的样品体积很小，导致灵敏度不高；此外，microRNA序列短，序列相似性高，不能同时优化所有待测的microRNA杂交环境，所以选择性不高。聚合酶链式反应(PCR)是现在定量检测microRNA的主要方法，包括引物延伸RT-PCR，茎环引物RT-PCR和microRNA加尾RT-PCR等方法。虽然基于聚合酶链式反应的microRNA检测方法具有快速、特异性强、灵敏度高等特点，但是需要逆转录操作，增加了实验的成本和设计的复杂性。随着新的microRNA序列不断发现和对microRNA功能研究的逐步深入，对microRNA的分析检测提出了新要求。因此，开发简单直接，灵敏度高，特异性强，准确检测microRNA的分析技术仍然是一个挑战。

发明内容

本发明涉及一种利用恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法，具有操作简单、灵敏度高、特异性强，背景信号低、线性检测范围宽、适用范围广等优点，是一种简便实用的分析技术。

本发明利用靶标microRNA诱导恒温扩增反应合成荧光纳米银簇探针定量检测microRNA的分析方法如下。设计一条含有三种功能序列的DNA扩增模板：与靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。从3’端到5’端排列顺序为靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列，靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列，和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。当靶标microRNA与DNA扩增模板结合后，诱导恒温扩增反应和nicking核酸内切酶特异性的酶切反应得到大量单链DNA产物，其中一种单链DNA产物能够与DNA扩增模板结合，继续充当靶标microRNA的引物作用，从而极大地提高扩增的效率。另一种单链DNA产物即为荧光纳米银簇的合成DNA序列，能与加入的硝酸银离子溶液在硼氢化钠还原作用下，合成荧光纳米银簇探针，在一定波长的入射光照射下，发射出相应的荧光，通过测定反应体系中的荧光信号并计算荧光改变值，与标准工作曲线比对，推算出靶标microRNA的浓度。此外，DNA扩增模板中功能序列也可以有不同的组合和排列模式，如从3’端到5’端排列顺序为靶标microRNA结合序列，nicking核酸内切酶酶切序列，合成荧光纳米簇的DNA互补序列，nicking核酸内切酶酶切序列，和合成荧光纳米簇的DNA互补序列。

本发明的方法可以进一步描述如下：

利用靶标microRNA与DNA扩增模板结合后，诱导恒温扩增反应和nicking核酸内切酶特异性的酶切反应得到单链DNA产物，该单链DNA产物与加入的硝酸银溶液在硼氢化钠还原作用下制备荧光纳米银簇探针，测定反应体系中的荧光信号并计算荧光信号改变值，与标准工作曲线比对，推算出靶标microRNA的浓度。

所述荧光纳米银簇探针粒径为1～10nm，激发波长为500～680nm，发射波长为510～900nm。

本发明的靶标microRNA检测方法包括以下操作步骤：

步骤1将靶标microRNA加入到DNA扩增模板溶液中，进行孵育反应；

步骤2向步骤1中所得的反应液中加入恒温扩增混合液，孵育反应后，热失活酶，终止反应；