[发明专利]肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法

说明书

本发明公开了一种肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法。本发明提供制备肝实质细胞的方法，包括如下步骤：1)将多潜能干细胞培养获得内胚层细胞；2)将获自步骤1)的内胚层细胞培养获得原始肠管细胞；3)将获自步骤2)的原始肠管细胞培养获得成肝细胞；其特征在于：将获自步骤2)的细胞进行传代，并转入到在含有成纤维细胞生长因子(FGF)和骨形态形成蛋白(BMP)的肝细胞诱导培养基I中培养，获得成肝细胞；4)将获自步骤3)的成肝细胞培养获得成熟的肝实质细胞。本发明还涉及根据所述方法制备的肝实质细胞。本发明制备的肝实质细胞较以往具有更高的代谢活性，制备效率高，应用前景广阔。

技术领域

本发明涉及肝实质细胞及其制备、鉴定与应用方法。

背景技术

肝脏在人体内代谢过程中起到重要的作用，包括糖原合成，尿素合成，脂肪代谢调控，以及药物解毒等等。肝脏细胞的损伤包括肝炎，肝癌，肝硬化会对人体生命安全造成极大的危害。要解决这种问题，就要能在体外获得大量肝脏细胞，利用这些细胞进行移植。在各种细胞来源中，人多潜能干细胞(pluripotent stem cells,PSCs)，包括人胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESC)和人诱导多能性干细胞(induced pluripotent stemcells，iPSC)，最具有应用潜力，人胚胎干细胞具有无限增殖的能力和分化的全能性，在合适的条件下可以分化为人体的各种细胞类型(Thomson et al.,Science.1998Nov 6；282(5391):1145-7)，是治疗各种退行性疾病的较好的供体细胞来源。另外，考虑到肝脏毒性是新药设计和检测中最重要的问题之一，大量的肝实质细胞来源可以极大推动建立新的药物的筛选策略。

经过十多年来的研究，目前人们在诱导人多潜能干细胞向肝实质细胞分化方面已经取得一定的进展。2007年我们在诱导人干细胞向肝脏细胞分化方面获得了较大的突破(Cai et al.,Hepatology.2007May；45(5):1229-39)。我们首先将整个的分化过程按照体内发育的模式划成几个阶段。首先利用Activin A有效的将胚胎干细胞诱导成内胚层细胞。然后参照体内发育的信号通路，激活FGF和BMP两条信号通路，促使内胚层细胞转变为早期肝母细胞。然后通过HGF的刺激促进肝母细胞的进一步分化，最后利用OSM和Dexamethasone促进肝实质细胞的成熟。这样逐步诱导的方案可以非常高效的产生肝实质细胞，得到的肝脏细胞占全体诱导物的70％左右。并且，这些人胚胎干细胞来源的细胞表达肝脏特异的标志基因和参与肝脏代谢功能的酶，能够分泌白蛋白，储存糖原，吸收并代谢吲哚花青绿，分泌低密度脂蛋白，并且能被HCV假病毒感染。移植试验发现人胚胎干细胞来源的肝脏细胞可以在免疫缺陷型的小鼠肝内维持至少两周。这些实验证明人胚胎干细胞可以高效率的分化成具有一定功能的肝脏实质细胞，将胚胎干细胞向肝脏细胞的分化推向了一个新的高度。随后，我们还进一步证明该分化方案也可以适用于人诱导多能性干细胞向肝实质细胞分化(Song et al.,Cell Research 2009Nov；19(11):1233-42)。最近，其他的实验组也报道了高效分化人多潜能干细胞得到肝脏细胞的实验方案。Stephen A.Duncan，Ludovic Vallier和Ian Wilmu等小组利用类似的分步诱导方法都得到了分泌白蛋白的肝脏细胞，并且能初步的检测到成熟肝细胞表达细胞色素P450酶。此外，Hesham Basma等人利用肝细胞表面特异标志ASGPR分选纯化从人ESC分化的来的肝细胞并移植到小鼠体内能看到明显的人源细胞重建小鼠肝脏并分泌人源的白蛋白。