[发明专利]一种用于短链RNA检测的欧米茄结构寡核苷酸引物及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种引物，特别涉及一种检测短链RNA的引物及其应用。 

背景技术

短链RNA在很多生物学、生理和病理过程中起着重要的基因调节作用。短链RNA中微小RNA(miRNA)是数量最多的一类。由于它与它的同类物DNA, RNA相比很短，发现起来较困难，因此近些年才发现它的存在。1993年，lin-4是第一个被发现的22nt短链RNA，它通过对靶基因lin-4信使RNA（mRNA）调节，在实验中对线虫发育时间表的启动和细胞分化起抑制作用。直到7年后，类似结构和功能的短链RNA在人类细胞中有更多的发现，才认定lin-4不是孤立的，并将其归为基因调节子的一类分子，即微小RNA（miRNA）的成员。

miRNA后来被发现在调节胚胎发生、发育、血管形成、细胞生长、细胞凋亡等方面具有功能活性。在一系列的病变过程中，如癌症发生，免疫缺陷，病毒感染等也发挥作用。Lu等发现比起正常组织miRNA在肿瘤中总的是下调趋势。进而，用miRNA表达谱可以分辨出低分化的肿瘤分类，而用信使RNA表达谱分析同样的样本得不出准确的结果。这些发现凸显出miRNA表达谱用于癌症诊断的巨大潜力。最近Resotta基因公司上市了一系列的miRNA癌细胞诊断试剂盒，并宣称这些试剂盒可以准确检测转移性癌细胞的来源。

尽管miRNA的功能和作用机理仍然需要进一步的研究阐明，但基于学术研究和医学诊断原因，围绕这些小分子检测和应用的研究越来越多。最近发现在体液中miRNA由于分子链短和argonaute复合体保护的原因，比起它们的信使RNA配对物要稳定的多。关于将血清或血浆miRNA表达谱做为癌症预测、癌细胞鉴别和分型等诊断工具的可能性评估已有不少报道。

由于序列短，核苷酸变异小以及缺少内控参照，只有22个核苷酸组成的miRNA，用现在最通用的检测信使RNA（mRNA）的方法检测根本不合适，例如，定量反转录实时PCR（qRT-PCR）虽然已经被发展成检测信使RNA（mRNA）表达和表达谱的黄金标准。而发现miRNA的方法多采用短链RNA克隆筛选，表达谱检测方法包括深度测序（deep sequencing），液相或固相杂交（hybridization）或基于RT-PCR的微阵列芯片技术（RT-PCR based microarrays）。从技术的角度来看，miRNA RT-PCR已经在miRNA表达谱和检测的众多策略中脱颖而出成为最准确和最灵敏的方法。因此，微阵列芯片的数据通常采用单目标RT-PCR测定（RT-PCR single-plex assay）来复核评价其准确性。

反转录是在反转录酶催化下，以RNA为模板的cDNA合成反应。一个寡核苷酸链退火互补到RNA链上作为反应起始点，然后cDNA从5’端到3’端，按照与RNA模板碱基互补的原则一个碱基接着一个碱基合成下去。在匹配区域碱基互补，引物和RNA模板才能形成双链体，这是反转录反应启动（引发）的必要条件。一般为了提供足够的Tm和特异性，保证在引物和目标（而非其它RNA）RNA模板之间专一地形成更紧密和稳定的双链体，引物通常设计成20-30nt（碱基）的长度。短链RNA，尤其是miRNA是一类短链寡核苷酸，平均链长18-30nt。由于链太短它们不能被传统的引物引发合成cDNA。为改善短链寡核苷酸的Tm有几种修饰可以采取，例如，用LNA寡核苷酸（寡聚锁核酸），连接一个较长的通用寡核苷酸接头到目标RNA上；用polyA多聚酶延长miRNA，以及采用茎环结构的引物。