[发明专利]海洋微生物发酵生产低温豆豉溶栓酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种低温豆豉溶栓酶海洋微生物发酵生产方法。该方法生产的海洋低温豆豉溶栓酶在溶解血栓、激活体内纤溶酶原方面有独特优势，可以广泛应用于溶栓药物和溶栓保健品的生产。

背景技术

豆豉溶栓酶(Nattokinase，简称NK)是一种碱性丝氨酸蛋白酶，无毒性，可口服(李江伟等，中国药学杂志，1999)，易被人体吸收，能直接溶解纤维蛋白，具有强烈溶栓功能(郝征红等，农业工程学报，2008；彭勇等，高技术通讯，2002)，且溶栓作用时间长，作为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物，具有广阔的应用前景(陶琳，氨基酸和生物资源，2004)。早期临床上应用最多的溶栓剂是链激酶、尿激酶等，虽可以促进血液中血纤维蛋白溶酶的形成或可以直接对血栓进行溶解，但都存在不同程度的不足，如半衰期短、抗原性强、副作用较大等，很难成为一种大众药品(卢露，中国调味品，2011)。溶栓研究中期阶段，鉴于NK独特的优势，对其研究开始起步并日渐增多，主要集中普通微生物发酵生产中温型NK，处于菌株选育、发酵条件优化、酶学性质，酶分离纯化以及工程菌构建等(陶琳，氨基酸和生物资源，2004；豆孝伟，现代食品科技，2006)，普通微生物发酵生产NK已然成为研究的热点。而海洋微生物发酵生产低温NK的研究尚在起步阶段，产业化、规模化海洋微生物发酵生产NK还未见报道。鉴于早期溶栓剂的不足，普通微生物大规模发酵的可行性，利用海洋微生物发酵生产低温NK具有先进性。海洋微生物发酵生产的NK与普通微生物发酵生产的中温NK具有很大的应用优势。普通微生物发酵生产的NK最适作用温度一般为45～55℃，而人体的生理温度一般为36.5～37℃，致使普通微生物发酵生产的NK不能充分发挥作用，出现治疗效果差或没有效果。海洋微生物(低温、寡营养、低光照、高压)发酵生产的NK最适作用温度一般为35～40℃，比较接近人体的生理温度，应用于治疗效果比较明显。海洋NK在生理温度下具有高酶活力及高催化效率，可大大缩短溶栓过程的时间，这将有助于NK在临床医学上的应用和推广，从根本上弥补早期临床溶栓药物的不足。鉴于海洋微生物发酵生产的NK上述的优势，海洋NK作为临床新型溶栓药物具有广阔的应用前景和开发潜力。

发明内容

本发明的目的是提供一种海洋微生物发酵生产低温NK的方法。该方法主要是海洋微生物经过定向驯化后，在常规条件下液体发酵生产低温NK的方法，这种生产方法获得的低温NK活性可以达到120U/ml，如再经过系列分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。口服2000U～4000U每日用量应用于小鼠实验，22～37天表现出明显的溶栓效果。该酶制剂应用方便、快捷、成本低。可以从根本上避免其它溶栓剂应用的弊端。

本发明所述的一种海洋微生物发酵生产低温NK的方法具体包括以下步骤：

(1)将产生低温NK的海洋微生物进行定向驯化，使其在培养条件下生长良好；

(2)按常规方法将低温NK产生菌在10～16℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在10～16℃培养60～96h时，即海洋微生物发酵生产低温NK结束；

(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；

(5)根据不同需要和使用对象不同，将(4)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。NK产生菌(例如，CGMCC菌种编号：1.47或1.3)先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产低温NK。驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25％甘油制成的菌悬液、在-80℃条件下可以长期保藏。

具体实施方式

实施例一：

(1)培养基制备

①菌种活化培养基：蛋白胨15.0g，牛肉膏10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.0，121℃高压蒸汽灭菌30min。

②菌种定向驯化培养基：蛋白胨3.0～7.0g，牛肉膏3.0～7.0g，纤维蛋白10.0～20.0g，NaCl 5.0～15.0g，琼脂18～22g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。