[发明专利]一种突变的中性植酸酶及其基因和用途

说明书

技术领域

本发明属于酶的基因工程和酶生化工程领域。本发明涉及活性提高的突变中性植酸酶，本发明还涉及编码该突变中性植酸酶的基因及用途。

背景技术

磷是动物必需的一种常量矿物元素，磷的添加对配合饲料生产成本及产品质量有重要影响。植酸酶(phytase)即肌醇六磷酸酶(myo-inositol hexaphosphate phosphohydrotase)是催化植酸及其植酸盐水解产生肌醇和磷酸(或者磷酸盐)这类酶的总称。添加植酸酶能够显著提高植物性饲料中磷的利用率，减少饲料中无机磷的添加量以及动物粪便中无机磷的排出，减轻环境的磷污染，提高畜牧生产和生态效益。

目前从微生物中获得植酸酶的报道有以下三种：(1)来源于大肠杆菌的双功能酶(appA)，它具有植酸酶和磷酸酶的功能，但只在酸性条件下表现出强的植酸酶活性；(2)来源于黑曲霉的酸性植酸酶(phyA)具有较高的活性，其酶促反应的pH有效范围在4.5-6.0之间，适用于胃呈酸性的单胃动物及少数鱼类；(3)来源于芽孢杆菌的中性植酸酶(phyC)，最适酶促反应pH在7.0-7.5之间适用于消化道为中性的鲤科鱼类，可有效弥补酸性植酸酶的不足。

国内外科研人员对中性植酸酶的研究主要集中于产酶菌筛选和基因工程菌的构建方面。姚斌等从枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis中克隆了中性植酸酶基因，并在大肠杆菌中进行了表达，表达产物具有生物学功能但比活较原始酶下降了30％(姚斌，袁铁铮，王元火，等.来源于Bacillus subtilis的中性植酸酶基因的克隆及在大肠杆菌的表达.生物工程学报，2001，17(1)：11-15)。陈艳等(陈艳，孙健义，赵学新，等.Bacillus amyloliquegaciens中性植酸酶基因的原核表达及蛋白纯化和性质.食品与生物技术学报，2005，24(2)：60-65.)将来源于淀粉液化芽孢杆菌的植酸酶在大肠杆菌中进行了表达，结果发现基因工程菌的植酸酶活性仅为出发菌株的1.27倍，表达重组酶活性偏低。近年来，Rao等(Rao DE，Rao KV，Reddy VD.Cloning and expression of Bacillus phytase gene(phy)in Escherichia coli and recovery of active enzyme from the inclusion bodies.Journal of Applied Microbiology.2008，105(3)：1128-1137.)在大肠杆菌中对芽孢杆菌中性植酸酶进行了高效表达，结果表明其最适pH为7.0，最适温度55℃，最大活性16U/mg。Tung等(Tung ET，Ma HW，Cheng C，et al.Stabilization of beta-propeller phytase by introducing Xaa-->Pro and Gly-->Ala substitutions at consensus positions.Protein Pept.Lett.，2008，15，297-299.)运用定点突变方法对Bacillus licheniformis植酸酶的热稳定性进行了改善，取得了较好的效果。定点突变结果表明，突变酶G117A/G266A与野生酶具有类似的米氏常数K_m，催化效率k_cat和最适的Ca²⁺浓度，但是热稳定性有大幅上升。

定点突变是蛋白质工程广泛采用的技术，它是根据酶的结构、功能和作用机理等信息，在基因水平进行核苷酸突变，以达到改造酶分子中特定氨基酸残基的目的，使酶的性质最佳化。利用生物信息工具进行蛋白质分子设计，并结合定点突变技术提高淀粉液化芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061中性植酸酶的活性，尚未见有关文献报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种突变的中性植酸酶，该突变的中性植酸酶与野生酶相比，在pH6.0～7.5下活性增加25-35％。

本发明的另一个目的是提供编码上述突变中性植酸酶的基因(核苷酸序列)，该突变的中性植酸酶基因可用于构建重组菌。

本发明的再一个目的是提供上述突变中性植酸酶的生产方法。

上述突变中性植酸酶核苷酸序列与野生酶核苷酸序列(GenBank登录号为HM747163)相比，第148位的编码天冬氨酸的密码子突变为编码谷氨酸的密码子。

本发明的目的可以通过以下措施达到：