[发明专利]一种菌丝霉素及其基因和制备方法

权利要求书

1.一种菌丝霉素的基因，其特征在于，所述的菌丝霉素的基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。

2.一种菌丝霉素融合蛋白，其特征在于，所述菌丝霉素融合蛋白氨基酸序列依次为保护肽段氨基酸序列，蛋白分离纯化标签氨基酸序列，蛋白酶的酶切位点氨基酸序列以及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

3.如权利要求2所述的菌丝融合蛋白，其特征在于，所述的蛋白分离纯化标签是组氨酸蛋白标签。

4.如权利要求2所述的菌丝融合蛋白，其特征在于，所述的蛋白酶的酶切位点是TEV酶的酶切位点。

5.如权利要求2所述的菌丝融合蛋白，其特征在于，所述菌丝霉素融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

6.一种菌丝霉素融合蛋白的基因，其特征在于，所述的菌丝霉素融合蛋白的基因是如下(1)或(2)的基因：

(1)其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.4所示；

(2)编码如权利要求2所述的菌丝霉素融合蛋白的基因。

7.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求1所述菌丝霉素的基因或如权利要求6所述菌丝霉素融合蛋白基因。

8.一种重组表达转化体，其特征在于，该重组表达转化体包含权利要求1所述的菌丝霉素基因、权利要求6所述的菌丝霉素融合蛋白基因或权利要求7所述的重组表达载体。

9.一种菌丝霉素蛋白的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)构建具有如权利要求7所述包含菌丝霉素融合蛋白基因的重组表达载体；将所得的重组表达载体转化到工程菌种中形成重组表达转化体，所述工程菌种选自大肠杆菌E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)和E.coli JM109中的一种或几种；

(2)培养步骤(1)所得的重组表达转化体表达菌丝霉素融合蛋白，培养基中IPTG浓度为0.05～1.0mmol/L，培养时间为1～6小时，破碎菌体并收集包含菌丝霉素融合蛋白的溶液；

(3)将步骤(2)所得包含菌丝霉素融合蛋白的溶液上样至亲和层析柱，以含有咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，咪唑浓度为60mM～300mM，收集含菌丝霉素融合蛋白的洗脱液；

(4)将步骤(3)所得的洗脱液加入TEV酶进行酶切，酶切产物经凝胶过滤进行脱盐处理；

(5)将步骤(4)所得酶切产物上样至亲和层析柱，以含有咪唑的洗脱液进行梯度洗脱，除去溶液中的保护肽段和TEV酶，收集含有菌丝霉素蛋白的洗脱液；

(6)将步骤(5)所得的含有菌丝霉素蛋白的洗脱液经过反相高效液相色谱层析，以含有乙腈的洗脱液进行梯度洗脱，其中乙腈的体积比含量为20％～80％，收集洗脱液即可。

10.如权利要求9所述的制备方法，其特征在于，步骤(4)所述的TEV酶切中TEV酶和菌丝霉素融合蛋白的质量比为0.125∶1～2∶1，酶切温度为4～37℃，酶切时间为0.5～6小时。