[发明专利]一种一步法裂解CPC生产7-ACA的酰化酶及编码它的多核苷酸

说明书

技术领域

本发明属于生化制药领域，特别涉及一种一步法裂解头孢菌素C(CPC)生产7-ACA的CPC酰化酶及其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及该CPC酰化酶的制备方法和它在合成7-氨基头孢烷酸中的应用。

背景技术

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)作为半合成头孢菌素类抗生素的关键中间体，在医药工业具有重要价值。工业上常采用化学法和两步酶法即利用头孢菌素C(Cephalosporin C，CPC)来生产7-ACA。但化学法工艺条件比较苛刻，需要处理多种有毒物质，环境污染严重。虽然两步酶法新工艺正在被广泛采用，但CPC首先由D-氨基酸氧化酶氧化为戊二酰-7-氨基头孢烷酸(glutaryl-7-ACA，GL-7-ACA)，随后GL-7-ACA由GL-7-ACA酰化酶水解为7-ACA。该方法涉及到两种酶的获取，相对化学法的成本优势无法突显，不能完全满足工业催化的需求。因此利用CPC酰化酶体外一步法裂解CPC生产7-ACA具有广阔的发展前景。本实验室刘艳等人根据CPC酰化酶基因和蛋白质序列信息通过聚合酶链式反应获得所需的模板DNA，并成功将其导入到顶头孢霉菌中，但获得的工程菌直接利用体内CPC酰化酶生成7-ACA的发酵单位远达不到工业化要求。文献报道现有的CPC酰化酶对CPC底物的特异性相对较低，是其对GL-7-ACA特异性的2％～4％(Matsuda A，Komatsu KI.Molecular cloning and structure of the gene for 7beta-(4-carboxybutanamido)cephalosporanic acid acylase from a Pseudomonas strain.J Bacteriol.1985Sep；163(3)：1222-1228)，因此对CPC酰化酶的人工改造显得尤为重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题就是针对现有的体外裂解CPC生产7-ACA的CPC酰化酶对底物的特异性较低以及底物耐受性较差、转化效率较低的问题，提供一种新的裂解CPC生产7-ACA的CPC酰化酶、该酶的编码基因、含有该编码基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及所述CPC酰化酶的生产方法及其在合成7-ACA中的应用。

本发明人根据CPC酰化酶基因和蛋白质序列信息通过PCR反应获得了所需的出发序列DNA模板，并在此基础上进行了大量CPC酰化酶突变体的设计构建和筛选工作。本发明人惊喜的发现其中一株突变体的CPC酰化酶活性和底物耐受性大大提高，本发明人继而考察了该突变位点突变为其他氨基酸的催化活性，证明该位点是一个重要的影响催化活性的位点，从而完成了本发明。

为解决上述技术问题本发明所采用的技术方案之一是：一种CPC酰化酶，其中所述CPC酰化酶是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的第180位的缬氨酸经过取代且具有CPC酰化酶活性的蛋白质；

(b)在(a)中的氨基酸序列的N端或C端添加一个或几个氨基酸且具有CPC酰化酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

其中(a)所述的SEQ ID NO.3为野生型CPC酰化酶的氨基酸序列。其中所述的具有CPC酰化酶活性的蛋白质较佳地是由(a)所述野生型CPC酰化酶的氨基酸序列中的第180位的缬氨酸被天冬酰胺、天冬氨酸、色氨酸、甘氨酸或丝氨酸所取代而衍生的蛋白质，最佳地是由(a)所述野生型CPC酰化酶氨基酸序列的第180位的缬氨酸被丙氨酸取代所衍生的具有CPC酰化酶的蛋白质，该蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

其中(b)所述的“几个”更佳地是指二个至小于100个，最佳的是小于30个氨基酸。所述氨基酸组成的肽段较佳地是信号肽(Signal peptide)，所述信号肽是指新生肽链N端的一段20～30氨基酸组成的肽段，该肽段的主要功能是决定新生肽链在细胞中的定位或决定某些氨基酸的修饰。信号肽较佳地包括：分泌信号肽、输出细胞核信号肽、输入线粒体信号肽、输入质体信号肽、输入过氧化物酶体信号肽、输入内质网信号肽、返回内质网信号肽、由质膜到内体信号肽等。