[发明专利]有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱

说明书

技术领域

本发明属于蛋白质组学领域，涉及一种分子印迹毛细管整体柱的制备方法，更具体地涉及一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱及其制备方法和应用。

背景技术

分子印迹技术是指制备具有特异性识别作用的客体目标分子的技术，是一种高选择性的仿生识别方法。模板与客体的作用如同“锁与钥匙”之间的作用。分子印迹技术具有三大显著特点：构效预定性（predetermination）、特异识别性（specific recognition）和广泛实用性（practicability），因而发展迅速，在许多领域如：色谱分离、固相萃取、仿生传感、模拟酶催化、临床药物分析研究等得到日益广泛的研究。近年来，分子印迹技术逐步拓展到蛋白质的分离、富集、纯化、鉴定等与蛋白质组学相关的生命科学领域。蛋白质印迹聚合物的制备方法主要有包埋法，表面印迹法，和抗原决定基法。目前报导的蛋白质分子印迹技术多为合成聚合物颗粒，其模板分子包埋严重，选择性低，蛋白质固有的特性如：体积庞大、构象灵活、结构复杂以及水溶性使得小分子的分子印迹技术不适用于制备蛋白质分子印迹整体柱，因而有关于蛋白质分子印迹整体柱的方法研究鲜有报道。蛋白质印迹的困难集中在如何保持印迹蛋白质构象的的完整性，提高蛋白质印迹聚合物的选择性。

整体柱又称连续床、棒状柱或无柱塞柱，是具有无孔填料和膜的快速分离能力，又有高效液相色谱（HPLC）多孔填料的高容量，却不增加柱背压的一种新型高效色谱填料，已被广泛用于高效液相色谱、毛细管电色谱及毛细管液相色谱中。目前制备整体柱的方法多采用自由基原位聚合的方法，与传统的填充柱相比，此方法具有制备简单、易于改性、高容量、传质快、柱效高以及试剂耗量少等优点，特别适合于来源宝贵的微量生物样品，是当前微分离分析领域的研究热点（Sykora. D, Svec. F, Frechet. J.M, J. Chromatogr. A, 1999, 852: 297）。按其基质不同，整体柱可分为有机聚合物整体柱和无机硅胶整体柱。有机聚合物整体柱是由单体、引发剂、致孔剂等混合物通过原位聚合制备而成的棒状整体，它具有制备简单、结构均匀、重现性较好、柱效较高及可进行快速分离等优点，但有机聚合物整体柱存在着固有的缺点如：机械强度相对较差，特别是在有机溶剂的作用下，柱体会发生收缩或溶胀现象，致使柱性能发生变化，导致柱寿命缩短，微孔结构不适宜小分子物质的分离和分析，柱容量低。无机硅胶整体柱则不存在上述缺点，硅胶整体柱的特殊结构使其具有极好的通透性，柱容量和柱效高，机械稳定性好，但也存在一定的缺陷如：制备繁琐、需高温老化、抗溶剂性能差，另外，该柱有一定的pH使用范围的限制。近年来发展的有机-无机杂化整体柱结合了有机聚合整体柱和无机硅胶整体柱的优点，具有宽的pH适用范围及良好的机械稳定性。然而，“一步”或“二步”催化法可供选择的有机硅烷种类较少，成本昂贵，反应时间过长，操作繁琐，严重制约着该方法的推广。最新发展的将“一锅法”应用于有机-无机整体柱的制备（Wu M.H, Wu R.A, Wang F.J, Ren L.B, Dong J, Liu Z, Zou H.F. Anal. Chem., 2009, 81: 3529）则有效地解决“一步”或“二步”催化法存在的问题。“一锅法”反应中的多步反应可以从相对简单的原料出发，不经中间体的分离，直接获得结构复杂的分子。具有取材广泛、反应条件温和、反应成本低廉以及环境友好等优点。

有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱兼具有机-无机杂化整体柱和分子印迹的优点，操作简单，选择性高，生物兼容性好，为蛋白质的选择性分离提供新的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱及其制备方法和应用，该方法制备过程简单，合成成本低，制备的整体柱具有高选择性及高物兼容性。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱的制备方法包括如下步骤：

1）将硅烷前驱体、分散剂以及催化剂混合，于冰水浴下剧烈搅拌至透明粘稠状；

2）将有机功能单体、交联剂、致孔剂、引发剂和模板蛋白混合，于0～4℃下超声至完全溶解后加入步骤1）的透明粘稠液，于0～4℃下超声至混合均匀，将混合液注入经乙烯基改性的石英毛细管内，密封后置于水浴锅内，于35～45℃和50～60℃下分别加热8～24小时完成聚合反应，再用十二烷基磺酸钠和乙酸的混合溶液冲洗制得所述的有机-无机杂化蛋白质分子印迹毛细管整体柱。