[发明专利]一种阿嗪霉素B的基因工程菌WSD2CP及制备方法和应用

权利要求书

1.一种阿嗪霉素的基因工程菌WSD2CP，其特征在于：Streptomyces sahachiroi菌株WSD2CP，CCTCC，CCTCC M2012098。

2.权利要求1所述的一种阿嗪霉素的基因工程菌WSD2CP的制备方法，其步骤是：

A、Streptomyces sahachiroi ATCC33158中aziD2基因缺失突变株的构建：

    构建同框缺失质粒，以含有aziD2基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，分别扩增大小为2.8 kb的同源左臂片段：aziD2L-for上游引物AAAAAGCTTCGCCTACGACGACCCCGACTAC TC；aziD2L-rev下游引物，AAATCTAGATTCGAGTCCGTGTCCGAGGCGTTC和大小为2.5 kb的同源右臂片段：aziD2R-for上游引物，AAATCTAGATGACTCCGGTCGGCCCACATTCAC；aziD2R-rev下游引物AAAGAATTCGGCAAGGTCACTCAAGACGGAACT，分别用两个片段上所设计的酶切位点进行处理后，通过三片段的连接方式，插入到自杀型载体pOJ260的克隆位点HindIII和EcoRI上，得到aziD2基因的同框缺失质粒pMSB-WS31，通过接合转移的方法将质粒pMSB-WS31导入到Streptomyces sahachiroi ATCC33158中，得到阿伯拉霉素抗性的单交换接合子，将接合子在无抗性的平板上松弛培养三代，收集孢子后于无抗平板上进行稀释涂布，影印到含有阿伯拉霉素的抗性平板上培养，挑出对阿伯拉霉素的菌株，抽总DNA用相应的引物：上游引物序列为AAATCTAGACCGCTGCATCCGCCACG CAAATACCTG，下游引物序列为AAAAAGCTTCTCAACGGGC GCAAGACCTACAACC进行PCR验证，野生型菌株ATCC33158的总DNA扩增出1.8 kb的特征带，aziD2基因缺失的菌株WSD2的总DNA能扩增出1.0 kb的特征带；

B、aziD2基因表达质粒的构建：

aziD2基因表达质粒的构建是基于链霉菌表达质粒pMSB-WS052进行，质粒pMSB-WS052是由链霉菌整合型载体pSET152改造，其多克隆位点上游具有组成型强启动子PermE*，表达载体pWS052构建方法如下：设计特异性引物：Perm-SpeI上游引物，TTGACTAGTGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGT；Perm-EcoRV下游引物，AAAGATATCTCTGGCTCACCGA CGACCCGC，以质粒pWHM4*为模板扩增得到含有启动子ermE*的片段，用引物上所设计的酶切位点处理后，插入到pSET152的XbaI和EcoRV位点间，得到载体pMSB-WS052，通过PCR的方法，以含有aziD2基因的链霉菌基因组文库质粒为模板，扩增大小为1.1 kb、包含RBS区域及aziD2基因编码区的DNA片段：aziD2-SpeI上游引物，ATTACTAGTATTCTGAGCAGCGCCCGGGTATTCAC；aziD2-XbaI下游引物AAATCTAGACGGGATGCCA GCGGAACGGTGAATGTG，用XbaI+SpeI酶切处理后，以正确的方向插入到载体pMSB-WS052的XbaI位点上，获得aziD2基因的表达质粒pWS052-D2；

C、 aziD2基因互补表达菌株WSD2CP的构建：

通过接合转移的方法将aziD2基因表达质粒pWS052-D2导入到aziD2基因缺失的菌株WSD2中，用阿伯拉霉素抗性筛选目的菌株，并用aziD2基因的扩增引物：aziD2-SpeI上游引物，ATTACTAGTATTCTGAGCAGCGCCCG GGTATTCAC；aziD2-XbaI下游引物AAATCTAGACGGGATGCCA GCGGAACGGTGAATGTG进行PCR验证，以互补菌株的总DNA为模板，扩增出1.1 kb的特征带，得到了反式互补aziD2基因的菌株WSD2CP。

3.权利要求1所述的一种阿嗪霉素的基因工程菌WSD2CP在发酵生产中的应用。