[发明专利]一种基于表面等离子共振技术的种质资源中特定DNA序列鉴定方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种种质资源中特定DNA序列鉴定技术，特别是基于表面等离子共振技术，核酸适配体与未标记和标记的样品特异性竞争识别，采用免疫球蛋白E修饰的传感元件间接鉴定种质资源中特定DNA序列的方法。

背景技术

种质资源是国民经济可持续发展的基础性战略资源。然而，近年来，我国种质资源流失严重，一方面我国拥有的人类遗传资源、重要经济作物资源、药用资源、工业微生物资源等通过非正当途径大量流失到国外；另一方面一些发达国家在我国建立植物提取物粗加工基地，掠夺性地从我国引进优等药材和资源性提取物。此外，长期以来，我国种质资源鉴定通常是根据形态标记来进行的，如株高、穗长、粒色等。此种形态标记简单直观，但存在数少、多态性差、易受环境条件影响等缺点。因此，导致我国种质资源保护工作面临着巨大的挑战，严重缺乏能满足巨大数量和多种类型物种资源检测鉴定的分析技术。

近10年来，在人类基因组研究计划的推动下，结合现代检测鉴定技术，分子标记的研究与应用得到了迅速的发展。荧光定量PCR技术可以通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，但该技术目前并不能准确地鉴定种质资源；而建立在PCR基础上直接测序的方法，成本昂贵，无法实现快速高通量检测鉴定。可以说，在物种遗传标记等真实性检测鉴定技术方面我国基本处于空白状态。以表面等离子体共振谱仪为技术平台，可以为种质资源中特定DNA序列的快速鉴定提供一种简便可靠的方法，大大缩短了检测鉴定时间，有望发展成为种质资源鉴定的标准化检测平台。但其存在传感芯片检测专一性和成本高问题。例如，采用表面等离子体共振原理检测的仪器BIACore，其常用传感器芯片SA芯片成本为3000多元人民币。因此，如何实现同一传感芯片检测不同特定DNA序列已成为表面等离子体共振检测领域热点研究问题。

发明内容

为了解决现有特定DNA序列分析技术存在的耗材量大、造价昂贵等问题，同时满足对种质资源中各种DNA序列的鉴定要求，本发明提供了一种种质资源中特定DNA的表面等离子体共振鉴定方法。该方法具有通用、高稳定性、高灵敏度、操作简单等优点，满足对种质资源中特定DNA序列的鉴定要求。

本发明的技术方案为：一种应用表面等离子共振仪的种质资源中特定DNA序列鉴定方法，利用同一传感芯片对不同种质资源中特定DNA序列进行鉴定；其特征在于包括以下步骤：

（一）传感芯片表面适配体固定：选择链霉亲和素SA修饰的传感芯片，通过通入5-50μL浓度为1-50μg/L已标记生物素的免疫球蛋白E适配体，在表面等离子体传感芯片上固定上免疫球蛋白E适配体；

（二）对特定单链DNA进行免疫球蛋白E标记，标记方法根据待测物基团不同；所述标记方法包括DNA的对苯二异硫氰酸酯修饰和与免疫球蛋白E的氨基偶联。如将水稻一段SSR单链与对苯二异硫氰酸酯反应后，再与免疫球蛋白E的氨基偶联，形成通过对苯二异硫氰酸酯连接的免疫球蛋白E-SSR序列偶联物，待用；

（三）标准溶液配制：用0.01-0.1mol/L（pH＝7.4）的磷酸盐缓冲液配置免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液，浓度为0.1ng/mL至1mg/mL，加入等量特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体充分混合，获得特定单链DNA标准溶液，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还可以大于加入的适配体量；

（四）建立对照曲线：采用表面等离子共振谱仪测量，以0.02mol/L的磷酸盐缓冲液为测量基准，通过微泵通入5-100μL特定单链DNA标准溶液，记录下表面等离子体共振仪光谱图，获得特定单链DNA表面溶液的表面等离子体共振谱图稳定值A；

（五）检测鉴定：提取种质资源总DNA，进行不对称PCR扩增反应，获得单链DNA；对于待测单链DNA样品进行一系列预处理，取待测单链DNA溶液与免疫球蛋白E标记的特定单链DNA溶液充分混合后，竞争结合特定单链DNA相应的适配体或纳米粒子修饰的适配体，其中免疫球蛋白E标记的特定单链DNA量还不少于加入的适配体量；采用表面等离子体共振检测仪记录待测单链DNA的光谱图；通过检测免疫球蛋白E，间接鉴定特定DNA是否存在；对比待测单链DNA样品的谱图稳定值B与特定单链DNA的谱图稳定值A，当B小于A时，说明种质资源中含有特定DNA序列，当B等于A时，说明不含有特定DNA序列；

（六）通入0.01-0.05mol/L（pH为2-3）的甘氨酸-盐酸缓冲溶液，冲洗传感芯片表面，进行传感元件再生，用于其它种质资源中特定DNA序列的鉴定。