[发明专利]一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法

权利要求书

1.一种利用扩张蛋白提高虫草多糖产量的液体发酵方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10～15％的接种量接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20～25℃，摇床培养2～4天，得种子液；

(2)将步骤(1)制得种子液按5～10％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20～25℃的条件下，液体发酵培养1～6天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.01～0.85mg/mL，然后继续培养2～9天，分离，得到蛹虫草菌丝体和发酵液；

(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取蛹虫草胞外多糖，从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内多糖，混合蛹虫草胞外多糖和蛹虫草胞内多糖，即得虫草多糖。

2.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化培养条件为：摇床转速100～160r/min，温度20～25℃，暗培养活化3～5天。

3.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中的种子发酵培养基，每升组分如下：

3g葡萄糖、1.5g酵母粉上清液、0.1g MgSO₄、0.03g CaCl₂、0.1g KH₂PO₄、0.1gK₂HPO₄，2～5颗直径3～6mm的玻璃珠。

4.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下：

3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、1.5g蛋白胨，0.1g MgSO₄、0.03g CaCl₂、0.1gKH₂PO₄、0.1g K₂HPO₄。

5.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.15～0.7mg/mL；进一步优选0.25～0.5mg/ml。最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为0.5mg/ml。

6.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，所述扩张蛋白溶液按如下方法制备：

将大豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％HgCl₂消毒4～6min，流水冲洗5～7h，然后，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗下胚轴顶端3～4cm，置-20℃预冷0.5h，加预冷至4℃的匀浆缓冲液，匀浆后，用孔径70μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，4℃下提取44～50h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH₄)₂SO₄，添加(NH₄)₂SO₄过程中不断搅拌，防止(NH₄)₂SO₄局部过饱和，然后静置45～50h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。

7.如权利要求6所述的液体发酵方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.5mmol/L Na₂S₂O₅，2mmol/L EDTA，0.1wt％ Triton X-100，pH 7.0；所述提取液组分为：15mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L乙二胺四乙酸，1.5mmol/LNa₂S₂O₅，0.5mol/L NaGl，pH 6.0；所述酸性缓冲液配制是：将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。

8.如权利要求1所述的液体发酵方法，其特征在于，步骤(2)中所述的分离是在15000r/min条件下离心分离5～10min。