[发明专利]一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用香菇液体发酵生产工业用酶制剂漆酶的方法，属于生物发酵工程技术领域。

背景技术

漆酶(Laccase，P-diphenol oxidase，EC 1.10.3.2)是一类结合多个铜离子的蛋白质，属于铜蓝氧化酶，存在菇、菌及植物中，其中以担子菌中的白腐菌中分布最为广泛。漆酶可存活于空气中，发生反应后唯一的产物是水，是一种环保型酵素。由于环保意识逐渐被人所重视，因此近年来漆酶国内外研究较热。真菌漆酶一般含有4个铜离子，其氧化还原电位比昆虫和植物漆酶高，可以氧化多种酚类、芳胺类、羧酸类、甾体激素与生物色素、金属有机化合物和一些非酚类底物，在废水处理、纸浆漂白、土壤净化、染料脱色、免疫检测等诸多现代工业领域里都能广泛应用。香菇(Lentinula edodes)又名香蕈，属担子菌纲，伞菌目，蘑菇科，皮裥属，学名香皮裥菌，在我国已有悠久的生产栽培历史。我国是全球最大的香菇生产国，目前在我国70％以上的省份均有栽培香菇，因此香菇具有价格低、产地多、易于培养的特点。香菇作为一种白腐真菌已被证明可以产生漆酶，而且其中包括多种同工酶，合称为总漆酶，且其酶的氧化还原活力比昆虫漆酶、植物漆酶都要高出很多。相比直接从香菇子实体中提取，低成本、高效的液体发酵技术是目前工业化发酵生产的发展方向，然而当前相关香菇发酵生产漆酶的研究很少，而且与香菇其它活性成分的发酵提取生产相比，其漆酶的产量仍然偏低，同时酶活性受到培养条件和基质成分等诸多因素的制约。已有报道利用芳香类化合物或重金属离子诱导提高产量，但是这些诱导物一般都具有毒性，且难于降解，添加后使发酵液处理成本增高，还易造成环境污染。利用液体静置培养或固态发酵技术能够缓解漆酶生产的环境污染问题，但发酵周期太长，不适合工业化发酵生产应用。

如中国专利文献CN1463578A(申请号02124094)，公开了一种香菇液体菌种的深层发酵培养方法及其培养基涉及菌种深层发酵培养方法及其培养基。该培养方法包括(1)将母种在母种培养基内进行培养；(2)将在母种培养基内培养长满试管的菌丝移种到木屑原种培养基内进行过渡培养，培养条件为：温度22～27±1℃，暗培养12～20天，待菌丝长满，(3)将木屑菌种充分打碎后立即移种到液体培养基中进行一级摇瓶的培养扩增；(4)将一级摇瓶内生长5～7天的菌液移入盛有新鲜液体培养基的二级摇瓶中进行扩增；(5)将二级摇瓶出来的菌液进行发酵处理即可得到成品香菇液体菌种。其它一些利用漆酶基因的异源表达的产量往往也低于野生菌。因此，这些都限制了目前漆酶的工业化生产应用，急需开发一种新的能够提高漆酶产率、降低生产成本的制备方法和生产工艺以满足现代工业化的需要。

近年来在植物细胞壁中发现一类称为扩张蛋白的新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白在植物形态建成(Fleming et al.，1999)、果实成熟(Cosgrove，2000)、根毛发生(Cho and Cosgrove，2002)、细胞扩张(Cosgrove，1998)、渗透调节(Wu and Cosgrove，2000)和禾本科植物花粉管生长(Cosgrove，1997)等诸多方面均起着极为重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验证明这种植物细胞壁蛋白有使热钝化的离体细胞壁恢复伸展的功能，推测其能够打断细胞壁多聚物之间的氢键进而调节酸依赖的细胞壁延展和压力松弛等生理活动，可能在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸等调控作用。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于香菇的液体发酵进行漆酶等次生代谢产物的生产国内外目前均未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法。

本发明技术方案如下：

一种利用香菇液体发酵生产漆酶的方法，包括如下步骤：

(1)将香菇菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，得种子液；

(2)将步骤(1)制得的种子液按5～15％体积比接种于液体发酵培养基中，在温度25～30℃的条件下，液体发酵培养1～5天，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为1.0～3.0mg/mL，然后继续培养4～8天，分离，取上清液，得到发酵液；

(3)从步骤(2)制得的发酵液中提取漆酶。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PD液体发酵培养基，每升组分如下：

去皮马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。