[发明专利]重组轮状病毒VP6载体蛋白及其制备

权利要求书

1.一种重组轮状病毒VP6载体蛋白，其特征在于重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因上有下列六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点：Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag），其中：

重组轮状病毒VP6载体蛋白编码基因的核苷酸序列如下：

   1 atggatgttt tgtattcatt atcaaaaact cttaaggatg ctagagacaa

  51 aattgtcgaa ggcactttat actctaatgt tagtgatcta attcaacaat

 101 ttaatcaaat gataattact atgaatggaa atgaatttca aactggagga

 151 attggtaatc taccaaccag aaattggagt tttgattttg gtttacttgg

 201 aactacgctt ttgaatttag atgccaatta tgttgaaact gcgcgtaaca

 251 caattgatta ttttgttgat tttgtagata acgtatgtat ggatgagatg

 301 gttagagaat cacaaagaaa cggaattgca ccgcagtcag aatcacttag

 351 aaaactatca gggattaagt ttaaaagaat aaattttgac aattcgtcgg

 401 aatacataga aaactggaac ttgcaaaata gaagacaaag aactggtttt

 451 acatttcata aaccaaacat ctttccatat tcagcttcat ttacgttaaa

 501 tagatcacaa cctgcgcatg agctcatggg tacaatgtgg ttgaatgcag

 551 gttcagagat tcaagttgct ggatttgatt attcgaacat acagcaattt

 601 gagcatatag ttcagctccg tagggtgtta acgacggcta caataactct

 651 tttaccagat gctgaaaggt ttagtttccc tagagtaatt aattcagctg

 701 atggtaccac atggtatttt aatccagtaa tacttagacc gaataatgtc

 751 gaagtagaat ttctattgaa tggacagata ataaatactt atcaggcacc

 801 taggtttggt acaattgtag ctagaaattt tgatactatt agattatcat

 851 ttcaattgat gagaccgcgg accccatcag tcgcagcact cgagcatcat

 901 gctactgtag gactaacatt acgcattgaa tctgcaattt gtgagtcagt

 951 gcttgctgat gctagtgaaa caatgttagc taatgtaaca tctgttagac

1001 aagaatatgc aataccagtt gggccagttt ttccaccagg tatgaattgg

1051 actgatttga ttactaacta ctcaccatct agagaggata atttacaacg

1101 tgtgtttaca gtagcttcca ttagaagcat gcttgttaaa tgataa

重组轮状病毒VP6载体蛋白由380个氨基酸组成，其氨基酸序列如下：

Met Asp Val Leu Tyr Ser Leu Ser Lys Thr Leu Lys Asp Ala Arg Asp Lys Ile Val Glu Gly Thr Leu Tyr Ser Asn Val Ser Asp Leu Ile Gln Gln Phe Asn Gln Met Ile Ile Thr Met Asn Gly Asn Glu Phe Gln Thr Gly Gly Ile Gly Asn Leu Pro Thr Arg Asn Trp Ser Phe Asp Phe Gly Leu Leu Gly Thr Thr Leu Leu Asn Leu Asp Ala Asn Tyr Val Glu Thr Ala Arg Asn Thr Ile Asp Tyr Phe Val Asp Phe Val Asp Asn Val Cys Met Asp Glu Met Val Arg Glu Ser Gln Arg Asn Gly Ile Ala Pro Gln Ser Glu Ser Leu Arg Lys Leu Ser Gly Ile Lys Phe Lys Arg Ile Asn Phe Asp Asn Ser Ser Glu Tyr Ile Glu Asn Trp Asn Leu Gln Asn Arg Arg Gln Arg Thr Gly Phe Thr Phe His Lys Pro Asn Ile Phe Pro Tyr Ser Ala Ser Phe Thr Leu Asn Arg Ser Gln Pro Ala His Glu Leu Met Gly Thr Met Trp Leu Asn Ala Gly Ser Glu Ile Gln Val Ala Gly Phe Asp Tyr Ser Asn Ile Gln Gln Phe Glu His Ile Val Gln Leu Arg Arg Val Leu Thr Thr Ala Thr Ile Thr Leu Leu Pro Asp Ala Glu Arg Phe Ser Phe Pro Arg Val Ile Asn Ser Ala Asp Gly Thr Thr Trp Tyr Phe Asn Pro Val Ile Leu Arg Pro Asn Asn Val Glu Val Glu Phe Leu Leu Asn Gly Gln Ile Ile Asn Thr Tyr Gln Ala Pro Arg Phe Gly Thr Ile Val Ala Arg Asn Phe Asp Thr Ile Arg Leu Ser Phe Gln Leu Met Arg Pro Arg Thr Pro Ser Val Ala Ala Leu Glu His His Ala Thr Val Gly Leu Thr Leu Arg Ile Glu Ser Ala Ile Cys Glu Ser Val Leu Ala Asp Ala Ser Glu Thr Met Leu Ala Asn Val Thr Ser Val Arg Gln Glu Tyr Ala Ile Pro Val Gly Pro Val Phe Pro Pro Gly Met Asn Trp Thr Asp Leu Ile Thr Asn Tyr Ser Pro Ser Arg Glu Asp Asn Leu Gln Arg Val Phe Thr Val Ala Ser Ile Arg Ser Met Leu Val Lys。

2.如权利要求1所述的重组轮状病毒VP6载体蛋白，其特征在于通过下列步骤构建：

1）根据轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白基因的核苷酸序列，人工设计下列引物对：

P174F：CATGAGCTCATGGGTACAATGTGG；

P174R：CATGAGCTCATGCGCAGGTTGTGA；

P197F：GATTATTCGAACATACAGCAATTTGAGCAT；

P197R：TATGTTCGAATAATCAAATCCAGCAAC；

P244F：GATGGTACCACATGGTATTTTAATCCA；

P244R；TGTGGTACCATCAGCTGAATTAATTAC ；

P275F：GCACCTAGGTTTGGTACAATTGTA ；

P275R：AAACCTAGGTGCCTGATAAGTATTTAT ；

P298F：AGACCGCGGACCCCATCAGTCGCA；

P298R：GGTCCGCGGTCTCATCAATTGAAATGA；

P308F：GCACTCGAGCATCATGCTACTGTA；

P308R：ATGCTCGAGTGCTGCGACTGATGG；

以及下列引物：

PETL5：ATCATATGGAGGTTCTGTACTC；

PVP6-3：TAGGATCCTTATCATTTAACAAGCATGCTTCTAAT；

2）以轮状病毒TB-Chen株VP6蛋白编码基因为模板，以下列为引物对，进行PCR扩增：

PETL5/P174R和P174F/PVP6-3；

PETL5/P197R和P197F/PVP6-3；

PETL5/P244R和P244F/PVP6-3；

PETL5/P275R和P275F/PVP6-3；

PETL5/P298R和P298F/PVP6-3；

PETL5/P308R和P308F/PVP6-3；

PCR扩增反应体系为：PCR反应混合液体积为100μl，其中，分别含有60pmol的上述各引物对，以及30ng模板DNA，1×10⁵ pmol的dNTPs，10μl的 10× PCR缓冲液，5U Taq DNA聚合酶，其余用水补足；PCR反应条件为：94℃预变性3 min，94℃变性40s，56℃复性30s，72℃延伸反应1min，共40个循环，最后72℃延伸10 min；分别得到：

带有Sac I位点序列的PCR扩增片段：6174F和6174R；

带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段：6197F和6197R；

带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段：6244F和6624R；

带有Bln I位点序列的PCR扩增片段：6275F和6275R；

带有Sac II位点序列的PCR扩增片段：6298F和6298R；

带有Xho I位点序列的PCR扩增片段：6308F和6308R；

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化上述六对扩增片段；

3）将步骤2）所得下列各扩增片段，按常规分别用下列对应的内切酶即内切酶I/内切酶II进行双酶切：

带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174F：Nde I/Sac I；

带有Sac I位点序列的PCR扩增片段6174R：Sac I/BamH I；

带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197F：Nde I/BspT104 I；

带有BspT104 I位点序列的PCR扩增片段6197R：BspT104 I/BamH I；

带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6244F：Nde I/Kpn I；

带有Kpn I位点序列的PCR扩增片段6624R：Kpn I/BamH I；

带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275F：Nde I/Bln I；

带有Bln I位点序列的PCR扩增片段6275R：Bln I/BamH I；

带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298F：Nde I/Sac II；

带有Sac II位点序列的PCR扩增片段6298R：Sac II/BamH I；

带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308F：Nde I/Xho I；

带有Xho I位点序列的PCR扩增片段6308R：Xho I/BamH I；

酶切反应体系为：分别含有3μl 的上述各基因片段，以及3μl的15U内切酶I ，3μl的15U内切酶II，和8μl的10×缓冲液及63μl的水；将各酶切混合液分别于37℃水浴反应3小时后，得对应的六个酶切片段，分别用1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离和纯化六个酶切片段；

4）将步骤3）所得六个酶切片段对分别与T4 DNA连接酶及缓冲液混合后，在18℃连接反应6h，最终在同一个VP6蛋白上构建出携带有Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个酶切位点的VP6载体蛋白编码基因；

5）、将步骤4）得到的VP6载体蛋白编码基因用常规的基因克隆和重组技术，连接到pET表达质粒DNA的Nde I/BamH I位点，得到携带VP6F载体蛋白编码基因的重组质粒：pET6F；

6）按常规将步骤5）所得重组质粒经菌体转化扩增后，进行酶切鉴定和核苷酸序列测定，之后将重组质粒pET6F在下列条件下分别转化BL21（DE3）感受态细胞：10μl 重组质粒pET6F与100μl的 BL21（DE3）感受态细胞混匀，冰上放置30分钟，42℃放置70秒钟，加入500μl的LB培养液后，在37℃培养30分钟；培养物涂在含200μg/ml氨苄青霉素的1.5%琼脂培养板上，将培养板于37℃培养14个小时，挑取单个菌落放入含200μg/ml氨苄青霉素的LB培养液中培养和表达，得携带有Sac I（gagctc），BspT104 I（ttcgaa），Kpn I（ggtacc），Bln I（cctagg），Sac II（ccgcgg），Xho I（ctcgag）六个供外源抗原表位基因插入的限制性内切酶位点的重组轮状病毒VP6载体蛋白rVP6F。