[发明专利]鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法

说明书

技术领域

本发明涉及RT-PCR检测技术，具体地说，涉及鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法。

背景技术

鸡传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis，IB)是鸡的一种急性、高度传染性的上呼吸道疾病，病原为传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)。IBV疫苗防控中的主要难点是该病毒血清型较多，并且不同血清型之间缺少有效的交叉保护性。因此生产中有效区分IBV疫苗株和流行野毒株并明确其血清型对该病的防控至关重要。

目前针对传染性支气管炎病毒进行病原学检测的方法主要有病毒分离鉴定和RT-PCR方法。病毒分离鉴定要将临床样品处理后接种合适的载体(通常是SPF鸡胚)通过观察特征性的鸡胚病变(侏儒胚)来进行初步鉴定，初步分离物还要通过中和试验进行进一步鉴定和进行血清分型，因此费时费力。常规RT-PCR方法由于M41类活疫苗的广泛使用而不能够区分疫苗毒和野毒株，具有明显的局限性。

对鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的系统研究结果表明，目前我国IBV临床上主要存在两种类型的毒株，一种为M41血清型毒株，约占25％，利用M41相关疫苗(如H120、H52、Ma5等)可有效进行防控。另一种毒株类型为A2-Like毒株，约占70％左右，必须使用对应的疫苗才能进行有效防控。这两类毒株之间的核苷酸同源性通常只有87％左右，这种明显的基因差异的存在为设计引物，建立更加实用的PCR检测方法提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测手段的不足，提供一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和流行株感染进行快速鉴别检测的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种鉴定鸡传染性支气管炎病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，包括以下步骤：

1)临床样品经预处理后，提取样本总RNA。

2)反转录(RT)得到样本cDNA。

3)以样本cDNA为模板，使用以下引物组合进行PCR扩增。

上游引物P1：5’-GACCACAGTCACGCACAA-3’；

下游引物P2：5’-AATCTCCTCGGGTTCATC-3’；

下游引物P3：5’-AACTACACTCAACAATGGA-3’；以及

下游引物P4：5’-CCTGATTCTTCTTGATAC-3’。

4)分析PCR扩增产物，结果判定。即对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中能否扩增出各目的条带。如果无目的条带则为鸡传染性支气管炎病毒检测阴性；如果扩增出通用目的条带(182bp)和疫苗株目的条带(470bp)则为鸡传染性支气管炎病毒疫苗株检测阳性；如果扩增出通用目的条带(182bp)和流行株目的条带(355bp)则为鸡传染性支气管炎病毒流行株检测阳性；如果同时扩增出通用目的条带和疫苗株、流行株目的条带则为疫苗株与流行株鸡传染性支气管炎病毒检测阳性，如果仅扩增出通用目的条带(182bp)则证明为其他类型毒株的传染性支气管炎病毒检测阳性。

本发明参照GenBank上登录的鸡传染性支气管炎病毒基因组的高度保守区段以及鸡传染性支气管炎病毒疫苗株和流行株(GenBank登录号分别为FJ888351、AY851295、EU817497)基因组的基因型间高度差异的区段设计4条检测引物序列：引物P1、引物P2、引物P3和引物P4。引物P1与P2组合可扩增182bp的鸡传染性支气管炎病毒通用目的基因片段，引物P1与P3组合可扩增355bp的流行株特异性目的基因片段，引物P1与P4组合可扩增470bp的常用疫苗株目的基因片段，适用于对鸡传染性支气管炎病毒常用疫苗株和主要流行野毒株进行快速鉴别检测。

前述检测方法中，步骤2)中反转录生成cDNA的方法为：

在0.2ml离心管内加入下列成分：

RNA溶液                    6μl

500μg/ml随机引物          1μl

轻轻混匀，70℃水浴5min，冰浴2min；

然后向上述离心管中加入下列成分：

轻轻混匀，将上述反应体系置于37℃ 1h，95℃ 5min，得到样本cDNA。

前述检测方法中，步骤3)中PCR反应体系以20μl计为：