[发明专利]利用静电纺丝制备硫酸化丝素蛋白血管组织工程支架的方法

说明书

(一)技术领域

本发明属于生物医用材料领域，特别是涉及一种具有良好抗凝血性能的硫酸化丝素蛋白血管组织工程支架的及其制备方法。

(二)背景技术

心血管类疾病严重危害人类身体健康，血管重建在临床外科中具有十分重要的地位，全球每年大约超过60万人需要接受各种血管外科手术，其中大多数都需要合适的血管移植物。目前，临床上应用的血管移植物主要包括自体血管、异体血管和人工合成血管，由于自体血管的来源有限以及异体血管的排异反应，使得人工血管移植术备受重视。目前，直径大于6毫米的大口径人工血管已经实现了商品化，而直径小于6毫米的小口径人工血管的临床应用非常令人失望。

小口径人工血管存在的主要问题是其植入人体后易发生急性血栓，而血管支架材料具有良好的生物相容性、优良的力学性能和长期稳定的血液相容性是其技术突破的关键。对支架材料进行抗凝血改性以提高小口径组织工程血管的长期抗血栓性已经成为当前国内外学者的研究重点。在材料表面结合抗凝血蛋白和种植血管内皮细胞都是改善支架材料抗凝血性能的有效途径。肝素是常见的抗凝血蛋白，肝素单纯涂层后可改善血液流变学性能，但结合的强度不够，易脱落导致过快释放。近年来，一些学者采用等离子体照射来改变材料表面结构，使材料表面生成具有反应活性的基团，将肝素以共价键形式固定在材料表面，但是其抗凝血效果并不令人满意。处于体内环境中的支架材料由于要接触到体液、有机大分子、酶、自由基、细胞等多种因素，其生物学环境极为复杂，采用表面改性的方法对材料长期抗凝血性能的改善较为有限，随着支架材料的降解和表面修饰层的脱落，其抗凝血性能虽然可以满足高血流量、低阻力的大口径血管的需要，但还是无法满足对抗凝血性能要求较高的小口径血管的需要。另一方面，在支架材料的内表面种植血管内皮细胞可以形成抗栓表层，能够降低组织工程血管内表面的凝血酶原的活性，从而提高材料的血液相容性特别是提高小口径组织工程血管的通畅率，然而内皮细胞在受到血流冲刷后保存率不足一直是困扰国内外学者的一大难题。研究表明，当植有内皮细胞的组织工程血管植入人体后，受到血流冲击最初的4～24小时内，会有30％～60％的内皮细胞脱落，而血管内皮层的修复需要一定的时间，在这段时间内血管形成血栓的可能性会极大增加，因此提高组织工程血管内皮层的保存率非常重要，而此时支架材料的抗凝血性能也显得尤为关键，这就要求小口径组织工程血管的支架材料既要具有良好的生物相容性，又要具有长期稳定的抗凝血性能。

近年来，丝素蛋白以其良好的细胞相容性和显著的机械性能引起越来越多的关注。在之前的研究中，我们对丝素蛋白进行抗凝血改性，制备了硫酸化丝素蛋白。研究结果表明，硫酸化丝素蛋白不但具有良好的血液相容性，而且可以促进血管内皮细胞的黏附、增殖并维持其功能。

(三)发明内容

本发明的目的是将具有良好细胞相容性和抗凝血性能的硫酸化丝素蛋白利用静电纺丝技术制备成管状的小口径组织工程血管支架材料，从而使该支架材料具有三维立体全方位的抗凝血性能，而不仅仅是表面具有抗凝血性能，支架的抗凝血性能不会随着表面涂层的脱落和降解而消失，而是会随着支架材料而一直长期稳定的存在。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

a)丝素蛋白的制备：

将家蚕丝置于0.1％的Na₂CO₃溶液中，于98～100℃处理30分钟，重复三次，以脱去蚕丝纤维表面的丝胶蛋白，在室温空气中晾干。将蚕丝纤维放入CaCl₂-CH₃CH₂OH-H₂O(摩尔比为1∶2∶8)溶液中溶解，保持温度在78±2℃并不断搅拌，得到丝素蛋白溶液，随后用透析管在蒸馏水中透析。最后，将丝素溶液冷冻干燥24小时制成丝素蛋白海绵；

b)硫酸化丝素蛋白的制备：

将10mL的氯磺酸缓慢均匀地加入到60mL的吡啶中，然后将步骤(b)制得的丝素蛋白海绵加入氯磺酸的吡啶溶液中，把体系温度逐步提高到80℃并保持一定时间。反应结束后，将200mL水加入到体系中，并用适量的氢氧化钠溶液中和反应溶液，将体系中的不溶物滤掉，加入500mL乙醇使可溶的硫酸化丝素蛋白析出，离心收集硫酸化丝素蛋白，并使其复溶于少量双蒸水中，制备一定浓度的硫酸化丝素蛋白溶液，冻干保存；

c)静电纺丝过程：