[发明专利]辣根细胞内外钙离子交换动态检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及辣根细胞内外钙离子交换动态的测定方法，属于分析化学和细胞生物学领域。

背景技术

    细胞膜的存在使得细胞内的各种物质能够稳定存在并进行生命体的化学反应，同时还能够选择性地运输对生命体至关重要的物质如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Cl^-等。生命体系中的信号传递与细胞之间的离子跨膜运输有着至关重要的联系，而离子的运输通常就是由细胞膜上的各种离子通道完成的。

膜片钳技术是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜上单一（或多个）离子通道分子活动的技术。然而，植物细胞膜片钳检测存在困难，如去壁活细胞初生壁的迅速生长造成质膜与微电极之间难以形成高阻封接；细胞膜破损后更难封接及检测；膜片钳检测需破膜，造成实验结果偏离真实值；细胞内外液中其它离子干扰严重。稀土处理后，对植物细胞造成伤害，导致膜片钳无法对植物细胞实现连续检测。

非损伤微测技术是实时、动态地测量活体或者非损伤性地测量材料表面的离子和分子的流速和运动方向，是基于物理学、化学、电学、生物学等原理集成的一项尖端技术。该技术并不探讨细胞内外的离子交换，同时，该技术的测试仪器昂贵，在我国使用不广泛。

离子选择性电极是一种能在多种离子存在下，用电位法测定溶液中给定离子活度的分析测量工具，因而又称为电位型化学传感器。电荷（电子和离子）在液/液界面或称之为两种互不相溶电解质溶液界面上的转移反应过程是最基本的物理化学过程之一。微、纳米级液/液界面常用于研究离子和加速离子在液/液界面上的快速转移反应动力学。

    膜片钳数据中的I～V曲线为各个膜电位处的电流值曲线，受此启发，根据离子选择性电极的原理，加之电化学的分析手段，我们开发了一种检测辣根细胞内外Ca²⁺交换的新方法。采用这种方法研究活细胞表面Ca²⁺浓度的变化，进而探讨离子通道性质和功能的变化。该方法弥补了传统检测方法膜片钳测定植物细胞的部分缺憾。在进行细胞测试时，无限接近细胞，对细胞无损伤。该方法将化学、细胞生物学、生物电化学等相关交叉学科研究方法组合，为外来物质尤其是金属离子对细胞膜离子交换能力的检测，提供新的借鉴。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的辣根细胞内外Ca²⁺交换的检测方法，具有灵敏度高、准确度好、选择性强、操作简单、分析速度快等优点。本发明的循环伏安法检测微电流法，实现了稀土离子对植物细胞内外表面Ca²⁺的连续检测。

本发明所述的用电化学循环伏安测定辣根细胞内外Ca²⁺交换的方法，是以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca²⁺载体的DCE溶液，为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用循环伏安法对辣根细胞内外Ca²⁺交换进行动态连续检测。

上述方案中纳米毛细管的循环伏安实验采用二电极体系，在屏蔽箱内的电解池中进行。

本发明还公开了所述方法在测定稀土离子对细胞表面Ca²⁺迁移影响中的应用。具体是：以硼硅毛细管为材料制备纳米毛细管，并进行内壁硅烷化使其变为疏水性；在内管壁疏水化的纳米毛细管内充入含有Ca²⁺载体的DCE溶液为有机相；辣根细胞溶液为水相，用Ag/AgCl为水相中参比电极，Ag/AgTPBCl为有机相中参比电极，利用循环伏安法对辣根细胞内外Ca²⁺交换进行检测；随后向细胞溶液中滴加一定浓度稀土离子，孵化5 min，进行循环伏安测定。得到不同浓度稀土离子处理后，细胞表面Ca²⁺在液/液界面迁移的循环伏安曲线。

本专利的创新之处在于：

    膜片钳记录的全细胞记录图表示的是细胞内外的K⁺交换的通道电流（包括稳态电流和尾电流），随着测试样品的加入，细胞内外的K⁺交换发生了变化，反映在通道电流改变上，并呈现剂量-效应关系，通道电流的变化反映了稀土离子对细胞K⁺通道功能的影响。（图2）