[发明专利]重组修饰的纤溶酶

说明书

发明背景

人纤溶酶原是包含791个氨基酸残基的单链蛋白。通过对酶原中Arg561-Val562肽键的单一的裂解，导致纤溶酶原激活成为纤溶酶。所得到的纤溶酶分子是双链的二硫键连接的丝氨酸蛋白酶，具有胰蛋白酶样特异性(在Lys和Arg之后裂解)。

纤溶酶的氨基-末端重链(残基1-561，大约60kDa)由五个三环域(kringle)组成，各自包含大约80个氨基酸残基。所述三环域负责纤溶酶原的调控特性，如与激活抑制剂例如Cl^-1离子的相互作用；与激活刺激剂例如ε-氨基己酸的相互作用；与哺乳动物和细菌细胞的相互作用；和与其他蛋白的相互作用，如纤溶酶生理学底物血纤蛋白和纤溶酶抑制剂α2-抗纤溶酶。在所有五个三环域中，三环域1是最多功能的一种；业已证实了它的赖氨酸-结合活性负责引起纤溶酶与α₂-抗纤溶酶和血纤蛋白的相互作用。参见Wiman，B.，et al.，Biochim.Biophys.Acta579：142-154(1979)；和Lucas，M.A.，et al.，J.Biol.Chem.258：4249-4256(1983)。

纤溶酶的C-末端轻链(残基562-791，大约25kDa)是典型的丝氨酸蛋白酶，与胰蛋白酶同源，并且包含典型的丝氨酸蛋白酶催化三联体：His603，Asp646和Ser741。纤溶酶原包含24个二硫键和在Asn289和Thr346上的2个糖基化位点。

业已证实弹性蛋白酶对纤溶酶原的有限的蛋白水解产生三个片段(Sottrup-Jensen，L.，et al.，Prog.Chem.Fibrinol.Thrombol.，3：191-209(1978))。第一个片段，K1-3，包括前三个三环域，并且能够以两种形式分离，Tyr79-Val338和Tyr79-Val354。第二个片段K4相当于第四个三环域，并且包括残基Val355-Ala440。最后一个是C-末端片段(所谓的小-纤溶酶原)，包括残基Val443-Asn791，并且由第五个三环域和丝氨酸蛋白酶结构域组成。小-纤溶酶原能够以与纤溶酶原相同的方式被激活，形成小-纤溶酶。

由于全长纤溶酶原分子的复杂结构，细菌表达系统未证实可用于纤溶酶原的重组生产。纤溶酶原是以不溶性的内含体形式生产的，并且不能够从那种状态再折叠。另外，纤溶酶原在哺乳动物细胞中的表达由于纤溶酶原在细胞内激活形成纤溶酶和所致的细胞毒性而复杂化。用昆虫细胞生产具有完全活性的纤溶酶原是可能的，不过，由于产量低该系统不适合大规模生产。

因此，需要修饰过的重组蛋白，它具备纤溶酶/纤溶酶原的理想特征，同时缺乏某些负面特征，并且能够以较大数量在细菌细胞中生产。

发明概述

本发明提供了包含编码多肽的核苷酸序列的多核苷酸，所述多肽具有与天然人纤溶酶原的三环域同源的单一的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域；其中，所述多肽能结合固定化的赖氨酸。所述N-末端三环域可与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源。

在某些实施方案中，所述编码的多肽与SEQ ID NO：2所示出的序列的同一性为至少90％，95％，或98％。另外，所述编码的多肽可以是SEQ ID NO：2所示出的序列。

所述多核苷酸的核苷酸序列可以是SEQ ID NO：1所示出的序列或其简并变体。所述核苷酸序列可以编码一种多肽，其具有与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域同源的N-末端三环域；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。所述核苷酸序列还可以编码这样的多肽，其具有单一的N-末端三环域，它与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4结构域至少90％相同；和与人纤溶酶原的激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域的同一性为至少90％的C-末端结构域。所述编码的多肽能够结合固定化的赖氨酸。

另一方面，本发明提供了多肽，其具有N-末端三环域，与天然人纤溶酶原的三环域同源；和与人纤溶酶原中的相应结构域同源的C-末端结构域激活位点和丝氨酸蛋白酶结构域。

在某些实施方案中，所述多肽可具有与天然人纤溶酶原的三环域1或三环域4同源的N-末端三环域。