[发明专利]一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物及制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及医药领域，具体为一种抗癌药物复合物，尤其是一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物及制备方法和应用。

背景技术

癌症是严重危害人类健康的主要疾病之一，有效地治疗癌症一直是世界瞩目的研究课题。反义核酸技术是近年发展的一种基因治疗肿瘤的有效方法，它以肿瘤发生相关基因为靶点，通过人工合成的反义寡核苷酸与之特异性互补结合，抑制靶向基因的表达而导致肿瘤细胞凋亡，具有高选择性、高效率、低毒性等特点。但是由于单纯的反义寡聚核苷酸很难进入肿瘤细胞或被降解而达不到治疗效果。研究表明通过选择合适的药物载体输送，可大大提高治疗恶性肿瘤的效果。因此，发展高效安全的基因载体系统在生物医学领域中具有重要意义。

纳米级羟基磷灰石具有良好的生物相容性，生物降解性和生物可吸收性并且无毒副作用，是发展新一代高效高性能药物前提，为治疗癌症这一人类重大疾病提供重要的理论和实验基础。近年来纳米磷酸钙的制备方法主要包括水热合成法、溶胶凝胶法、化学沉淀法和微乳法等，其中，微乳法的微乳液结构限制了颗粒的大小，使纳米微粒的制备成为可能。纳米微粒的制备通常是将两种确定的微乳体系通过混合实现的。含有反应物A，B的两个微乳液经过混合、相互的碰撞或聚结、反应成核和生长等形成纳米微粒。当水核内的微粒长到最后尺寸，表面活性剂分子将附着在微粒的表面，使微粒稳定并防止其进一步长大，最终形成的微粒粒径受到形成的水核大小调控，控制其达到合适的尺寸。

多孔的磷酸钙纳米粒子在药物载体上的应用具有如下优点：1)磷酸钙纳米粒子具有良好的生物相容性，对生物体系的毒性小；2)制备的磷酸钙纳米粒子具有有序的孔道，因而具有较大的比表面积，为药物、蛋白质、DNA及核酸等提供了更多的负载空间，大大提高负载量；

生存素(survivin)是近年来发现的一种凋亡抑制蛋白(IAP)，它主要抑制凋亡中主要的效应蛋白酶caspase3和caspase7来介导凋亡的抑制。在多数恶性肿瘤组织中表达丰富，但在相应正常组织中不表达，这种选择性表达特性使其成为目前恶性肿瘤诊断和治疗的新靶点。而针对生存素(survivin)基因作为药物治疗靶点，负载其反义寡聚核苷酸的多孔磷酸钙纳米粒子药物复合物未见报道。

发明内容

本发明的目的，在于提供一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物及其制备方法。

本发明的另一目的，在于将上述多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物用于制备治疗宫颈癌的药物。

为实现上述目的，本发明的技术解决方案是：

一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸复合物，含有生存素反义寡聚核苷酸或者带荧光标记生存素反义寡聚核苷酸，粒径为30～60nm。

一种多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物的制备，其特征在于包括以下步骤：

(1)将微乳液I和微乳液II以2000～4000rpm速度搅拌3～7min；两者体积比为1∶0.8～1∶1.2；

微乳液I以乙二醇丁醚和环己烷的混合物为溶剂，含有0.3～0.5μg/mL生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、1～3mmol/L Na₂HPO₄和0.1～0.25mmol/L硅酸钠；乙二醇丁醚与环己烷体积比为1∶2～1∶4；制备方法为，将含有生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs、Na₂HPO₄、成核剂硅酸钠的水溶液与乙二醇丁醚、环己烷混合均匀；

微乳液II以乙二醇丁醚和环己烷的混合物为溶剂，含有氯化钙；微乳液II中氯化钙含量为2～4mmol/L；乙二醇丁醚与环己烷体积比为1∶2～1∶4；制备方法为，将氯化钙水溶液与乙二醇丁醚和环己烷混合均匀；

Na₂HPO₄与氯化钙的摩尔比为1∶1～1∶2；生存素ASODNs或6’-fam-生存素ASODNs与氯化钙的用量比为150～200μg/mmol。

(2)继续反应2～3min，加入分散剂柠檬酸钠继续反应10～12min；柠檬酸在总反应体系中含量为0.005～0.01mmol/L；

(3)离心取沉淀洗涤。

通过上述反相微乳法制备得到的多孔磷酸钙纳米粒子-反义寡聚核苷酸药物复合物，可介导反义寡聚核苷酸进入细胞，具有较高的细胞转染率，尤其是体外Hela宫颈癌细胞。显著提高反义核酸促进肿瘤细胞凋亡效率，增强其抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物，尤其是治疗宫颈癌的药物。