[发明专利]一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和SNP位点的试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，特别涉及一种基于热稳定性内切酶检测基因突变和SNP位点的试剂盒和方法。

背景技术

个体化医疗，就是针对病人的特征，因病因人用药，使病人在获得最大利益的同时使毒副作用减少到最轻。目前，基因突变(点突变、缺失突变、插入突变)和单核苷酸多态性(SNP)在个体化医疗中引起广泛关注。

肺癌是严重危害人民生命和健康的常见病。研究表明表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与肺癌病人对抗肿瘤药物易瑞莎的敏感性有关，其中以19号外显子内缺失突变以及21号外显子的点突变L858R最为常见。但当用药一段时间后，EGFR基因会发生二次突变，导致耐药产生。EGFR基因耐药主要突变型为Thr790位点的Thr790Met突变，发生C＞T突变。此外，若肺癌患者存在K-ras原发性基因突变，即使存在EGFR基因敏感性突变，对易瑞莎等靶向药物也会产生耐药。主要突变型为Gly12位点的Gly12Arg、Gly12Cys、Gly12Ser、Gly12Ala、Gly12Asp、Gly12Val，Gly13位点的Gly13Asp、Gly13Val。因此，在对肺癌患者选择进行靶向药物治疗或对用药肺癌患者进行用药监控时，需对EGFR基因Thr790Met突变和K-ras基因的主要突变型进行检测，以确认是否用药有效。

此外，K-ras基因突变与大肠癌等肿瘤患者酪氨酸激酶抑制剂等靶向药物的原发性耐药有关。K-ras基因突变检测做为结直肠癌患者进入个体化靶向治疗疗程之前需要进行的检测，已经被NCCN(美国癌症综合网络)列为《结肠癌临床治疗指南》中必不可少的一项。K-ras基因野生型的患者能从爱必妥(Erbitux，又称西妥昔单抗/Cetuximab)或维克替比(Vectibix，又称帕尼单抗/Panitumumab)治疗中获益，而K-ras基因突变的大肠癌患者治疗效果较差。美国FDA和欧洲药监局明确规定了在使用靶向药物爱必妥和维克替比治疗转移性大肠癌前必须检测K-ras基因。

单核苷酸多态性(SNP)是人类基因组中最常见的遗传多态性表达形式，SNP在基因组中分布相当广泛，在人类基因组中每300-1000碱基对就出现一次，SNP总量大概是3×10⁶个。近年的研究表明，SNP位点与个体表型差异、对药物或疾病的易感性相关。因此，SNP位点的研究已广泛用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究中等。

SNP位点的检测，在个体化医疗中也具有广泛的应用前景和价值。例如，核苷酸切除修复(NER)和碱基切除修复(BER)是人体内两种极为重要的DNA修复途径，XRCC1和ERCC1基因分别在NER和BER途径中发挥重要作用。XRCC1中Arg399Gln(CAG→CGG)多态性位于蛋白质重要的结构域内，ERCC1中Asn118Asn多态性(对应于AAC和AAT的无义突变)能够影响到ERCC1蛋白的表达水平，这两个基因的多态性影响到肿瘤细胞对铂类化疗药物的敏感性。有研究表明XRCC1基因中399位GG基因型患者采用铂类药物的疗效更佳，而ERCC1基因中118位密码子CC基因型对铂类药物化疗反应性较好。因此，可通过对SNP位点的检测实现个体化用药指导。

目前，DNA测序法仍然是检测SNP位点和基因突变使用最多的方法，但需要获取组织、分离细胞、提取核酸和进行测序，所需时间长、费用高，对取材和技术要求都比较严格，因此应用于临床仍受到一定程度的限制。

发明内容

为解决现有技术中存在的技术问题，本发明将热稳定性内切酶与Taq酶融合在一个反应体系中，通过在实时荧光定量PCR中对野生型基因进行实时酶切，从而实现对突变基因和SNP位点的检测，为临床提供一种简便、快速、准确和经济的SNP位点和基因突变分析方法。

因此，本发明的一个目的在于提供一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的试剂盒。

本发明的另一个目的在于提供一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的方法，利用该方法可以提高检测基因突变的分辨率。

根据一个方面，本发明提供一种检测基因突变(包括点突变、缺失突变和插入突变)和SNP位点的试剂盒，其中，所述试剂盒包含酶切野生型基因的热稳定性内切酶。本发明中，所述试剂盒包含扩增引物，优选地，在所述扩增引物中通过错配碱基的方式引入所述热稳定性内切酶的酶切位点，从而使所述热稳定性内切酶在PCR反应的同时酶切野生型PCR产物。