[发明专利]猪鼻支原体巢式PCR检测方法

权利要求书

1.一种猪鼻支原体的巢式PCR检测方法，其特征在于包括下列步骤：

1）提取猪鼻支原体样品的DNA，低温保存备用；

2）以一对特异性引物Mhr P01、Mhr P02对猪鼻支原体样品进行第一轮 PCR扩增；

其中：上游引物 Mhr P01的序列为：5’-GCATCTATATTTTCGCCAATAGC-3’；

下游引物 Mhr P02的序列为：5’-AGCTAGAGTTTCATCATTACC-3’；

所述第一轮 PCR扩增方法是：在PCR试剂管Ⅰ中的反应液总体积为20μl，包括：待测样品猪鼻支原体DNA模板提取液0.5~1.0μl， 10×PCR Buffer(Mg²⁺ Free) 1.0~2.5 μl， 25mM MgCl₂ 1.0~2.0μl，2.5mM dNTPs 1.0~3.0 μl，10pmol/μl上游引物Mhr P01 0.5~1.0μl，10pmol/μl下游引物Mhr P02 0.5~1.0μl， 5单位/μl TaqDNA聚合酶0.2~0.5μl，灭菌超纯水补至总体积20μl，3000~5000g离心2~5秒钟混匀，置于PCR仪内扩增反应；反应条件为：通过94~96℃ 解链2~5分钟，然后94~96℃变性40~60秒，50~56℃复性60秒，72℃延伸40~90秒，25~35个循环，最后72℃延伸6~10分钟，得猪鼻支原体第一轮PCR产物；

3）以另一对特异性引物Mhr P03、Mhr P04对猪鼻支原体第一轮PCR产物进行第二轮PCR扩增；

其中：上游引物 Mhr P03的序列为：5’-GTAGTCAAGCAAGAGGATGT-3’；

下游引物 Mhr P04的序列为：5’-GCTGGAGTTATTATACCAGGA-3’；

所述第二轮PCR扩增方法是：在PCR试剂管Ⅱ中加入猪鼻支原体第一轮PCR产物进行反应，其反应液总体积为20μl，包括：猪鼻支原体第一轮PCR产物0.5~.1.0μl， 10×PCR Buffer(Mg²⁺ Free) 1.0~2.5 μl， 25mM MgCl₂ 1.0~2.0μl，2.5mM dNTPs 1.0~3.0 μl，10pmol/μl上游引物Mhr P03 0.5~1.0μl，10pmol/μl下游引物Mhr P04 0.5~1.0μl， 5单位/μl TaqDNA聚合酶0.2~0.5μl，灭菌超纯水补至总体积20μl，3000~5000g离心2~5秒钟混匀，置于PCR仪内扩增反应；反应条件为：通过94~96℃解链2~5分钟，然后94~96℃变性40~60秒，46~50℃复性60秒，72℃延伸60~90秒，25~30个循环，最后72℃延伸6~10分钟，得猪鼻支原体第二轮PCR产物；

 4）电泳检测

取猪鼻支原体第二轮PCR产物5~10μl，与2~6μl 0.25%（质量/体积）溴酚蓝上样缓冲液混合，在含0.8~2%（质量/体积）Goldview的0.7~1%（质量/体积）琼脂糖凝胶在电压80~100V下电泳20~30分钟，于凝胶成像系统中透射紫外灯下拍照检测，样品孔有一条346bp的核酸条带为有猪鼻支原体感染或污染的阳性样品，即可确定待测样品中含有病原菌猪鼻支原体，反之则没有。

2.如权利要求1所述的猪鼻支原体的巢式PCR检测方法，其特征在于所述dNTPs为dTTP与dATP、dCTP、dGTP四种浓度分别为2.5mM核苷酸的混合物。

3.如权利要求1或2所述检测猪鼻支原体巢式PCR方法，其特征在于所述第一轮PCR扩增的PCR反应管I中的反应液的最佳组分为：待测样品猪鼻支原体DNA模板提取液1.0μl，10×PCR Buffer(Mg²⁺ Free) 2.0 μl，25mM MgCl₂ 2.0μl，2.5mM dNTPs 2.0μl，10pmol/μl上游引物Mhr P01 0.5μl，10pmol/μl下游引物Mhr P02 0.5μl，5单位/μl TaqDNA聚合酶0.2μl，灭菌超纯水补至总体积20μl。