[发明专利]一种小球藻蛋白分子制备及鉴定方法

权利要求书

1.一种小球藻蛋白分子制备方法，其特征在于：

将小球藻泥悬浮于pH 7.0的0.001mol/L磷酸缓冲液(PBS)中，反复冻融3次；冰浴中超声波破碎9min；在温度4℃条件下，采用12000r/min离心30min，取上清液，加30％饱和度硫酸铵；在温度4℃条件下静置24h，再在温度4℃条件下，采用12000r/min离心30min；将上清液用超滤杯浓缩至200mL，沉淀用少量PBS溶解，置入透析膜于pH 7.0的0.001mol/L PBS中搅拌透析2d，聚乙二醇-6000包埋浓缩至60mL；

经硅胶柱层析：将代谢产物干法拌硅胶后通过硅胶柱层析进行粗分离，洗脱液依次为石油醚、体积比1∶1的石油醚∶二氯甲烷、体积比1∶2的石油醚∶二氯甲烷、二氯甲烷、体积比5∶1的二氯甲烷∶甲醇、体积比5∶3的二氯甲烷∶甲醇、体积比1∶1的二氯甲烷∶甲醇、甲醇、体积比1∶1的甲醇∶水；

再经TLC薄板层析：TLC薄板层析使用硅胶铝板，展层剂采用二氯甲烷和甲醇不同体积(V/V)配比的溶剂，样品展层后在254nm的紫外照射下，用5ml浓硫酸溶解于100ml乙醇中的5％硫酸喷洒后，在温度100℃条件下加热5min，进行检测；具有相同展层斑点的分离相合并，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行纯度鉴定，Bradford法测定蛋白含量。

2.一种小球藻蛋白分子检测方法，其特征在于：

高效液相色谱HPLC纯化纯度检测：采用双泵系统，流动相采用去离子水和甲醇，以不同体积(V/V)配比的溶剂洗脱，使用系列电子光电管检测器(DAD)检测；

HPLC/ESI -Q-q-TOF-MS测定：纯化的蛋白分子的分子量用HPLC/ESI-Q-q-TOF-MS进行测定，测定条件为：电喷雾离子源ESI正离子模式poshive mode；扫描范围100-1000：毛细管电压：3.5KV；喷雾气压：0.278Mpa(45psi)；干燥器流速：12.0L/min；气体温度：350℃；裂解电压：200V；锥孔电压：60V；破碎电压：100V；参比溶液：121.0509，922.0098；分辨率9500±500(922.0098)；

NMR测定：纯化的蛋白样品溶解于氘代丙酮中，NMR[¹H，¹³C，homonuclear correlation spectroscopy(COPY)，heteronuclear single quantum coherence spectroscopy(HSQC)，和heteronuclear multiple bond correlation spectroscopy(HMBC)]用BRUKER核磁共振仪测定，测定¹H在400Hz条件下操作，测定¹³C在100Mz条件下操作，tetramethylsiane(TMS)作为内标。