[发明专利]一种检测参芪扶正注射液中大分子物质的方法

说明书

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，具体涉及一种检测参芪扶正注射液中大分子物质的方法。

背景技术

参芪扶正注射液作为一种中药注射液，主要由党参、黄芪制备而成，参芪扶正注射液的原料的提取过程中会产生大量的如蛋白质、多糖、多肽、鞣质等大分子杂质，而大分子杂质是产生过敏性反应等不良反应的主要原因，其中，大分子多糖一般为蛋白多糖，该糖蛋白的抗原性高于原有的蛋白质，同时单纯的多糖也能够作为免疫佐剂来增强过敏反应。因此在注射液生产过程中这些大分子如果不能去除干净，有可能引起患者过敏、红肿等不良反应。

广东省不良反应检测中心开展了对参芪扶正注射液上市后安全性再评价研究，其不良反应累积发生率为0.2％，属“偶见”，主要表现为皮疹、刺激痛、过敏等。这些不良反应主要是因为注射液中存在的大分子物质引起的。因此，建立对有害大分子物质的检查及限量监控方法对于保证参芪扶正注射液的安全性是非常重要的。

目前学术界对于产生不良反应的大分子物质的分子量没有形成统一的界限，认为中药注射液的疗效来自所含的小分子物质，与分子量大于3000的物质无关，然而许多中药中分子量大于3000的多糖和蛋白的大分子物质仍具有很强的药物活性，若将此类中药注射液中分子量大于3000的物质除去，该注射液的安全性会增加，但是药效则会大大降低。目前未有文献公开参芪注射液中易发生副反应的大分子物质的具体分子量界限，而常规多糖和蛋白质检测方法无法对不同分子量的大分子物质分别进行检测，对于参芪扶正注射液而言，既能保证其安全性，又能保证其有效性的检测方法未见相关文献报道。

参芪扶正注射液不同于普通注射液之处在于，由于中药提取过程中不可避免地产生的色素残留，若直接使用如Folin-酚试剂法、Bradford法等显色反应检测蛋白质和多糖会导致检测结果产生严重误差，因此使用显色法进行检测前，需要除去注射液中的色素，诸如中国专利申请201010504574.4公开了中药注射液中的微量蛋白质检测方法，而在中药注射液本身具有色素的情况下(如参芪扶正注射液为黄色液体)，则需要增加脱色步骤才不会影响最终结果，而使用蛋白特异性吸附膜脱色时，浸泡时间至少需要15小时，由此可见，该方法操作时间过长，步骤繁琐。

参芪扶正注射液作为一种中药注射液，注射液中的蛋白质、多糖大分子成分不能使用常规检测方法检测，因为使用常规方法进行检测时，其他成分可能会对检测结果产生较大的影响。为了消除其他成分的影响，中药注射液中大分子物质的检测方法通常比较复杂。中国专利ZL200610001838.8公开了一种测定注射液高分子物质含量的方法，该方法采用高效液相色谱法，虽然测定结果的灵敏度高，但是需要使用参照物，操作步骤较为繁杂。

中国专利申请201110002873.2采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定生脉注射液中微量蛋白，该方法操作步骤较多，成本较高。

现行药典(2010版)制定了中药注射液中的蛋白质、鞣质、树脂、草酸盐的物质检测标准，但没有特别制定大分子物质蛋白质、多肽、多糖的质量控制标准。而且药典中控制中药注射液蛋白的磺基水杨酸比浊法灵敏度低，且易受到注射液本身颜色的干扰影响判断。

发明内容

鉴于现有的蛋白质和多糖的质量控制标准，已经远远落后于中药注射液的质量控制需要，为了提高对中药注射液的有效成分的质控水平，本发明以参芪扶正注射液为研究实例，建立了一种简便有效的检测方法，可用于检测注射液中大分子物质蛋白质、多糖的存在情况。该方法对于大分子物质多糖、蛋白质类检测灵敏度均可达微克级，远低于引起过敏反应的量，可应用在注射液成品及生产、贮存过程中的大分子物质的监控及检测，以防止在临床使用中产生过敏反应。

本发明实验证明，参芪扶正注射液分子量大于3.8KD的大分子多糖和蛋白容易导致不良反应的发生。因此，本发明采用超滤离心的方法分离分子量大于3.8KD的大分子物质，再用常规的BCA法和Molish法检测分离出来的大分子蛋白和多糖，即可消除注射液中的其他成分对实验结果的影响。

本发明通过以下技术方案实现上述目的。

本发明提供一种检验参芪扶正注射液中大分子物质的方法，该方法包括如下步骤：

(1)采用超滤离心法对参芪扶正注射液进行超滤离心处理，并在超滤离心后的上层截留液部分加入超纯水，混匀后离心，直至洗出部分用Molish反应检测呈阴性，收集上层截留液；