[发明专利]杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体

说明书

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素总量单克隆抗体。 

背景技术

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉分泌产生的次生代谢产物，是能引起人畜各种损害的天然有毒化合物。黄曲霉毒素品种较多，目前被已发现20余种。黄曲霉毒素具有污染广、毒性强、危害重等特点。因此，全球至今至少有70个以上的国家制定了农产品及食品中黄曲霉毒素限量标准，很多国家更是制定了主要黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的限量标准。因此黄曲霉毒素总量分析方法显得尤为重要。 

现有黄曲霉毒素的检测方法包括薄层层析法、精密仪器分析法和免疫学分析法。其中薄层层析法是检测黄曲霉毒素最常用的检测方法，其不需要特殊的仪器设备，一般实验室都可进行，但试剂用量大、操作繁琐、其它组分干扰严重、准确性差，不能准确定量，且对实验人员和周围环境污染危害较大，不适于现场快速检测。精密仪器分析法包括荧光分光光度法和高效液相色谱法，其灵敏度高，准确性好，但仪器昂贵，要求黄曲霉毒素样品纯化程度高，样品前处理过程繁琐，耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。近些年发展起来的免疫分析技术克服了前两者的缺点，具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、成本低、对实验人员和周围环境的污染危害小、适于现场批量检测等优点。 

免疫分析是利用抗原和抗体的特异性反应和抗体（或抗原）上标记物的生物、物理或化学放大作用来对超微量残留物进行定性、定量检测，所以要研究建立针对黄曲霉毒素总量分析方法的任何一种免疫学检测技术，都必须先制得抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量的抗体。事实上无论国内还是国际上研制黄曲霉毒素抗体的报道很多，黄曲霉毒素通用抗体也有报道，甚至也有个别学者将黄曲霉通用抗体用来建立黄曲霉毒素总量分析方法。黄曲霉毒素通用抗体主要强调抗体对各种黄曲霉毒素均可发生较强的特异性结合反应，可被用来分别建立每种黄曲霉毒素的免疫分析方法；而黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量抗体则不仅强调抗体对各种黄曲霉毒素均可发生较强的特异性结合反应，而且还特别强调应用该抗体建立的针对每种黄曲霉毒素的免疫分析方法的灵敏度一致性要强。国内外现有报道的黄曲霉毒素通用抗体通用性都是比较强的，但针对每种黄曲霉毒素的分析灵敏度一致性却通常都较差，因此，这些报道的黄曲霉毒素通用抗体并不适合用来建立黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量分析方法，即使建立了黄曲霉毒素总量分析方法，其定量分析的准确性也会大打折扣。因此，研制黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量抗体对实现黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量免疫快速定量检测具有重要意义。 

发明内容

本发明所要解决的问题是提供杂交瘤细胞株10G4及其产生的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体。 

本发明提供了杂交瘤细胞株10G4，该细胞株已于2010年7月13日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO. C201016，分类命名为小鼠杂交瘤细胞10G4。其具有序列表中SEQ ID NO.1所示的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体重链可变区编码基因序列和序列表中SEQ ID NO.2所示的抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体轻链可变区编码基因序列。 

抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO. C201016的杂交瘤细胞株10G4分泌产生。其重链可变区具有序列表中SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列；轻链可变区具有序列表中SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列。 

本发明提供的杂交瘤细胞株10G4是采用两步筛选法获得的，其具体步骤为：将BALB/c小鼠经黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA免疫4-6次后，用2倍于前一次免疫剂量的黄曲霉毒素完全抗原AFB1-BSA作最后一次加强免疫，3天后进行细胞融合，采用ELISA方法分两步进行筛选融合细胞：第一步采用间接ELISA法筛选出抗黄曲霉毒素B1而不抗载体蛋白BSA的阳性孔；第二步采用间接竞争ELISA法对第一步筛选出的阳性孔培养液进行检测，用黄曲霉毒素G2作为竞争原——因为国内外现有报道的黄曲霉毒素通用抗体对黄曲霉毒素G2的交叉反应率往往是最小的（＜50%），选择吸光值和灵敏度均较高的孔，采用有限稀释法进行克隆，克隆后10天左右采用同样的两步筛选法进行检测，如此重复克隆2-3次后，最终筛选获得杂交瘤细胞株10G4。 

抗黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量单克隆抗体在黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2总量测定中的应用。