[发明专利]诺如病毒P粒子基因PGENE及表达诺如病毒P粒子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域人工合成的病毒基因以及在大肠杆菌中表达活性蛋白的方法，具体是根据诺如病毒VA387的P粒子的氨基酸序列合成PGENE基因以及在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法。

背景技术

Norovirus(NVs)病毒原名为诺瓦克样病毒，NVs是导致人类非细菌性急性胃、肠炎的主要病原，该病毒可以感染各年龄段人群，特别是婴幼儿、老年人和免疫系统缺陷病人属于易感人群。该病毒全年均可发生，冬季属于高发期(Mounts A W，et al传染病学2000，181(2)：284-287)；NVs的感染率非常高，感染力仅次于轮状病毒(Boga J A，et al微生物诊断2004，42(6)：2668-2674)。由于NVs属于正义单链RNA病毒(Green K Y，et al传染病学，2000，181(2)：S322-330)，NVs基因组易变异，导致其抗原性改变，病毒株得以进化，进而感染易感宿主，给疫情控制上带来相当大的难度，并且可能出现交叉感染的现象，目前，对NVs疫苗的研究仅局限于病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，通过生产NVs的衣壳蛋白作为其亚基疫苗是NVs疫苗研究的一个热点。P粒子是NVs衣壳蛋白单体形成12聚体小蛋白分子，VLPs和P粒子均具有免疫原性，口服后，均可引起宿主免疫反应，而通过对NVs的VLPs和P粒子与人组织血型抗原(human Histo-Blood Group Antigen，HBGA)亲合力研究发现，P粒子的免疫原性要强于VLPs，而且P粒子结构稳定，是研制NVs疫苗更佳候选者。不同NVs毒株与人HBGA的结合存在差异，文献《Hutson A M，et al.传染病学，2002，185(9)：1335-1337》对8种NVs毒株(I型的NV、C59和VA115；II型的VA207、VA387、GrV、MxV和MOH)研究发现，MOH不能识别O血型的HBGA，NV不能识别B血型的HBGA，而VA387可以识别腺体和ABO血型的所有HBGA。由于VA387识别HBGA的广泛性，因此，合成VA387病毒株的衣壳蛋白的PGENE基因，并构建质粒表达载体pET32，从而生产VA387的P粒子作为NVs亚基疫苗，这对今后研制NVs口服亚基疫苗提供了一定的参考和借鉴价值。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供诺如病毒P粒子的基因PGENE，并通过构建质粒表达载体pET32，在大肠杆菌中表达诺如病毒株VA387的P粒子这一活性蛋白分子的方法。本发明提供的P粒子的免疫原性要强于VLPs，而且P粒子结构稳定，该P粒子作为NVs口服亚基疫苗，在广泛预防Norovirus病毒感染上具有重要应用价值。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种诺如病毒P粒子的PGENE基因，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。

一种质粒载体，该载体包括SEQ ID NO.1所示的碱基序列。

一种在大肠杆菌中表达诺如病毒P粒子的方法，该方法包括以下步骤：

步骤一、含目的基因(PGENE基因)表达载体的构建

(1)通过生物合成的方法，合成PGENE的核苷酸序列，并将其克隆入pUC57质粒中，命名为pUC57-PGENE；

(2)用Hind III和BamH I对克隆的pUC57-PGENE质粒载体进行双酶切，获得1029bp的小片段，同时用BamHI和HindIII对pET32a质粒进行酶切；

(3)利用胶回收试剂盒分别回收所述pUC57-PGENE酶切产物的小片段DNA分子和所述质粒pET32a酶切产物的大片段DNA分子，用T4连接酶连接所述小片段DNA分子和所述大片段DNA分子，获得重组质粒pET32-PGENE；

(4)将所述重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，并在LB液体培养基中培养所述大肠杆菌DH5α，然后4℃条件下8000rmp离心5min，取菌体在加有氨苄抗生素的LB固体培养基上图板，筛选单菌落，挑取抗性单菌落进行PCR扩增检测和测序检测；

(5)将所述单菌落摇菌培养扩增，并抽提其质粒pET32-PGENE，并将该质粒用冻融法导入大肠杆菌BL21中，获得包含目的基因表达载体的大肠杆菌BL21工程菌；

步骤二、工程菌的培养及P粒子的诱导

(1)取所述工程菌于LB液体培养基中，37℃过夜培养，再接着继代培养；