[发明专利]PGENE基因以及在番茄系统中表达PGENE功能蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基因工程领域人工合成的病毒基因以及在植物中表达功能蛋白的方法，具体涉及一种诺如病毒P粒子的PGENE基因以及在番茄系统中表达PGENE功能蛋白的方法。

背景技术

诺如病毒(Norovirus，简称NVs)是导致人类非细菌性急性胃、肠炎的主要病原；该病毒可以感染各年龄段人群，婴幼儿、老年人和免疫系统缺陷病人属于易感人群；该病全年均可发生，冬季属于高发期(MountsAW，etal传染病学2000，181(2)：284-287)；感染力仅次于轮状病毒(BogaJA，etal微生物诊断2004，42(6)：2668-2674)。NVs属于正义单链RNA病毒(GreenKY，etal传染病学，2000，181(2)：S322-330)，NVs基因组易发生变异，导致其抗原性改变，毒株进化较快，因而疫情难以控制。疫苗是临床防治NVs疫情爆发主要手段之一，NVs衣壳蛋白的亚基疫苗是NVs疫苗研究热点之一。实验证实(XiaM，etal医学杂志2007，79(1)：74-83)，小鼠通过肌肉注射或喂饲酵母源的VA387的VLPs可以产生免疫应答，未经纯化的酵母提取物在没有佐剂情况下也可诱导小鼠产生免疫反应；用昆虫表达诺如病毒VLPs用于注射小鼠时，同样能引起小鼠的免疫应答。

目前，对NVs疫苗研究仅局限于病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)，而用NVs衣壳蛋白P粒子作为亚基疫苗，特别是用植物系统生产NVs衣壳蛋白P粒子疫苗尚未见报道。

发明内容

本发明目的在于克服现有技术中的不足，按植物偏爱密码子设计合成诺如病毒P粒子基因并提供一种在转基因番茄果实中生产口服NVs衣壳蛋白P粒子疫苗的方法，通过食用转基因番茄果实达到预防诺如病毒的感染，本产品在广泛预防Norovirus病毒感染和生产预防和治疗疫苗方面弥补了细菌、酵母和昆虫等表达病毒样颗粒的局限性，具有重要应用和理论价值。

本发明通过以下技术方案实现：

一种诺如病毒P粒子的PGENE基因，是按照植物偏爱子密码设计合成的核苷酸序列，将该基因置于番茄果实特异表达启动子E8基因下游，并在其5′端添加编码6×His-tag核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

一种表达载体，该表达载体包括如SEQIDNO.1所示的碱基序列。

一种在番茄中表达PGENE功能蛋白的方法，该方法包括如下步骤：

步骤一，PGENE基因表达载体的构建，所述构建的具体过程如下：

(1)、用SpeI和BstEII双酶切含有PGENE基因的载体pUC57-PGENE，回收目标DNA片段，获得带有相应粘性末端的目的基因PGENE，同时利用SpeI和BstEII双酶切载体p2302-gfp(该载体骨架为pCAMBIA2301)，回收大片段，然后将两个所述片段连接并转化大肠杆菌DH5α，得到中间载体p2302-PGENE；

(2)、用KpnI和SpeI双酶切中间载体p2302-PGENE，并用相同的酶切含有番茄果实特异性表达E8启动子全长的载体pMD18T-E8full2，回收目的DNA片段；

(3)、将回收的所述目的DNA片段连接构成表达载体质粒，用PCR和测序两种方法鉴定所述表达载体质粒，在确认所述表达载体质粒中目的基因阅读框架正确无误前提下，将所述表达载体质粒用冻融法导入农杆菌中，获得包含PGENE基因表达载体质粒的农杆菌；

步骤二、所述包含PGENE基因表达载体质粒的农杆菌转化番茄，所述转化的具体过程如下：

(1)将表面消毒的黄樱桃番茄22号(Solanum lycopersicum var.cerasiforme yellow cherry No.22)种子播于MS发苗培养基上，取其小苗的下胚轴和子叶作为外植体进行遗传转化；

(2)将所述包含PGENE基因表达载体的农杆菌于28℃摇菌培养至OD₆₀₀＝0.8～1.0时，室温6000rpm离心5分钟；

(3)弃上清，菌体用MS液体培养基重悬，然后加入无菌外植体浸泡6分钟；

(4)取出转化后的外植体，置于共培养基上，在25℃暗黑条件下共培养36小时；

(5)共培养结束后将所述外植体转移到愈伤组织诱导培养基上，在25～28℃光照下培养，光周期为光照16h和黑暗8h，培养至愈伤组织形成，然后转到分化培养基上培养至有再生芽从所述外植体切口处长出；