[发明专利]一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法

权利要求书

1.一种观赏鱼用红酵母微生态制剂的制备方法，该制备方法包括红酵母的分离、红酵母的鉴定及红酵母微生态制剂的制备；其特征是：无菌操作对斑马鱼的体表用 75%的酒精消毒，取其肠道中部，置于盛有10mL 的无菌生理盐水的离心管中，剪碎混匀，取适量均匀涂布于马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，保持培养基内的温度为恒温25-28℃，培养3天；挑选典型菌落转种到新的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基上，反复传代2～3 次，筛选出目的酵母接种到斜面备用；所述的马铃薯葡萄糖琼脂PDA培养基的成分及制备方法为: 去皮马铃薯190-210g，葡萄糖 18-20g及琼脂 13.5-16.5g，由去离子水定容至990-1010 mL， PH值为7-8，115-126℃条件下灭菌18-22min；红酵母的鉴定包括生理生化实验及26S rDNA 的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析；红酵母微生态制剂的制备方法包括菌株提取、菌株活化、菌株扩培及菌株收集浓缩。

2.根据权利要求1所述的生理生化实验；其特征是：酵母糖发酵和碳源同化的实验按常规方法进行，保持培养基内为恒温25-28℃，培养2～5天，观察结果。

3.根据权利要求1所述的26S rDNA 的聚合酶链式反应PCR扩增及序列分析；其特征是：提取酵母菌 DNA 后，选取26S rDNA D1 /D2 区的PCR 反应体系进行PCR扩增，采用 BLAST 和Clustalx1. 83 程序进行26S rDNA 序列比对分析，进而构建系统发育树和置信度检测。

4.根据权利要求1所述的红酵母微生态制剂的制备方法；其特征是：①取一株提取的红酵母菌Rhodotorula glutinis，在PDA培养基上保持恒温25-28℃培养3天，在发酵培养基中保持恒温25-28℃、190-210rpm摇床培养4-6天；所述的发酵培养基为：去皮马铃薯190-210g，葡萄糖 18-22g，蛋白胨2.5-3.5g，KH₂PO₄ 0.9-1.1g ，MgSO₄0.4-0.6g,由去离子水定容至990-1010 mL， PH值为7.4，在115-126℃条件下灭菌18-22min；②用牙签从斜面刮取一块菌种接种于PDA液体培养基试管中保持恒温25-28℃，培养3天，再将其接种于发酵培养基试管中保持恒温25-28℃，培养3天，接种量为10⁶ CFU/ml，反复3次；③将步骤                                                的液体菌种接种于装有发酵培养基的三角瓶中，在恒温28℃、200rpm摇床培养5天，接种量为10⁶ CFU/ml；④在无菌条件下，将步骤的摇瓶培养菌液用0.22um微滤膜过滤浓缩成500亿CFU/ml 菌液。