[发明专利]建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列的克隆方法及其realtimePCR方法

权利要求书

1.一种建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列的克隆方法，按照以下步骤实现：建鲤血液基因组DNA提取，设计引物、PCR扩增，产物纯化，转入载体，蓝白斑筛选，质粒测序，其特征在于：所设计的引物序列为：

正向：CCGTTCATGCTATCACAGCTACACA

反向：GGAAGCAGGATCTTACCATGTGAC

用此方法克隆所得建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列为如SEQ ID中No.1所述。

2.根据权利要求1所述克隆方法，其特征在于：所述PCR扩增的反应条件为：95℃ 3min；30循环94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 1min；72℃延长8min；4℃度保存。

3.一种real time PCR扩增权利要求1中所述建鲤GAPDH基因含内含子的部分序列的方法，按如下步骤实现：抽提总RNA，以Oigo dT Primer和Random 6 mers为引物进行RT反应，然后以此RT液为模板进行real time PCR，荧光染料为SYBR Green I，其特征在于：real time PCR中的建鲤引物为跨越内含子的定量引物，其序列为：

正向： AGCTCAATGGCAAGCTTACTGG

反向： GTGGATACCACCTGGTCCTCTG。

4.根据权利要求3中所述real time PCR扩增方法，其特征在于，所述real time PCR扩增的反应条件为：94℃ 3min，然后40个循环94℃ 5sec，62℃ 20sec，最后72℃ 3min，4℃保存。