[发明专利]一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于微生物菌种构建领域，尤其是一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用。

背景技术

苯酚是一种有毒有机的化工原料，是工业废水废渣中的主要污染物，我国把苯酚列入严重污染环境和危害人体健康优先污染物的“黑名单”之中。目前，采用微生物降解含酚废水因耗能少、成本较低、二次污染少等优点成为了处理含酚废水的常用的方法之一。研究学者从自然界中筛选分离出来能够降解苯酚的高效微生物菌种，通过研究其降解特性、降解条件、对苯酚的耐受性以及降解效率，进而有针对性地将菌剂投入到污水处理系统中，得到较好的处理效果。杨彦希等从炼油厂附近严重污染的废水和土壤中通过富集分离筛选到12株丝孢酵母及假丝酵母，这12株菌都能够以苯酚为唯一碳源生长，24-28h内降解苯酚质量浓度可高达1200mg/L，其中一菌株降解苯酚质量浓度最高可达1700mg/L。袁丽娟等从一绝缘材料厂的污水中分离得到一株可高效降解苯酚的菌株Bacillus simplex JY01，在接种量为2％，pH为6.0-9.0，温度为18℃-36℃的条件下，在30h内，当苯酚浓度为1100mg/L和1300mg/L时，其降解率分别为99.16％和74.76％。显然，通过筛选菌株，引入高降解活性菌株能够提高含酚废水的降解率，其意义是重大的。

但是对于这些难降解的污染物，仅靠自然界中的微生物有时是不够的，如何使这些优良菌株长期地在生物处理系统中占优势，并保持其高降解活性是我们需要解决的主要问题，而且提高降解速率是生物处理含酚废水的一个关键问题，其中向微生物中引入编码相应酶的基因进行菌株改造，是解决这一问题的主要途径，也可以说工程菌的构建前景是肯定的。

微生物好氧降解苯酚的代谢过程是微生物利用苯酚羟化酶将苯酚氧化为邻苯二酚，邻苯二酚由邻位和间位途径经环裂解最终形成乙酰辅酶A、琥珀酸、丙酮酸等，这些产物进入三羧酸循环(TCA)，继续被微生物利用，一部分生成细胞物质，另一部分则被氧化分解为二氧化碳和水，提供微生物新陈代谢作需的能量。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种降解苯酚的基因工程菌及其构建方法和应用，本发明从铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01中克隆的苯酚羟化酶基因，通过克隆、表达苯酚羟化酶基因构建苯酚降解菌工程菌。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种降解苯酚的基因工程菌，含有苯酚羟化酶基因。

而且，所述苯酚羟化酶基因来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa PA01。

而且，所述基因工程菌的宿主菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB1342。

一种降解苯酚的基因工程菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：

(1)PCR扩增苯酚羟化酶基因

从GenBank数据库中检索出铜绿假单胞杆菌PA01中苯酚羟化酶大亚基N的基因保守序列，利用DNAMAN软件设计引物进行扩增获得目的片段，正向引物见序列1，反向引物见序列2，PCR扩增获得苯酚羟化酶基因；

(2)重组质粒的构建

用BamHI和SalI进行双酶切PCR产物，与同样经过BamHI和SalI双酶切的克隆表达载体pWB980相连接；

(3)转化

将步骤(2)的连接产物转入E.coli DH5α感受态中，取150μL转化产物，涂布于包含卡那霉素的LB平板上，37℃，210-230rpm过夜培养，挑取单菌落，分装含有卡那霉素的LB培养基，37℃，210-230rpm培养8-15h，提取质粒，重组质粒经PCR及酶切鉴定目的片段已经插入了载体，将验证成功的重组质粒转化进入枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis DB1342中，获得降解苯酚的基因工程菌。

一种降解苯酚的基因工程菌在降解苯酚中的应用。

本发明的优点和积极效果是：

1、本发明从铜绿假单胞杆菌Pseudomonas aeruginosaPA01基因组中克隆到一个编码苯酚羟化酶基因，通过DNA重组技术在体外克隆表达构建得到苯酚降解菌，并进一步验证本重组菌降酚特性，获得了对苯酚的具有较强降解能力的遗传工程菌，这将对苯酚降解菌的工业化生产提供新的理论依据。

2、本发明中表达的苯酚羟化酶是苯酚降解过程中关键酶，通过克隆和表达苯酚羟化酶基因获得降解苯酚的工程菌，为酶法或生物法高效降解苯酚提供了很好的实现途径。