[发明专利]一种铜绿假单胞菌脂肪酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种编码铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa脂肪酶铜绿假单胞菌脂肪酶的基因。本发明还涉及所述基因在生产生物柴油方面及饲料添加剂等方面的应用。

背景技术

脂肪酶是重要的工业酶制剂品种之一，可以催化解脂、酯交换、酯合成等反应，广泛应用于油脂加工、食品、医药、日化等工业。特别是利用脂肪酶，可以用油脂为原料，在常温常压下生产生物柴油，具有条件温和、甲醇用量少和能耗低、环保性能好等优点。此称为生物(酶)法生产生物柴油

但是，生物(酶)法生产生物柴油需要有较高活性的脂肪酶。这是由于生产中必须添加甲醇或乙醇，另外，在生物(酶)法合成柴油的同时，会得到副产品甘油。而酶在甲醇或乙醇等中容易失活，并且甘油也会在一定程度上影响酶活性。

由于目前的脂肪酶活性较低，所以需要开发能够提高酶活性的脂肪酶。

发明内容

本发明的目的是找到一种脂肪酶蛋白基因。该基因的核苷酸序列编码的脂肪酶蛋白须具较高酶活性，可用于生产生物柴油及饲料添加剂。

本发明从铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa获得了如SEQ ID NO：1所示序列的DNA分子，达到上述发明目的。方法为：

本发明从公共数据库GenBank和Swissprot中已公开的脂肪酶基因序列，用ClustalW进行多序列比对，利用生物信息软件分析脂肪酶的转脂位点保守区和蛋白的稳定化和折叠的结构功能区域，选择铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa提取DNA，采用L ip-up：5′(BamHI)-GG ATCCATGAAGAAG AAGTCTCTGCTCCCC-3′和L ip-down：5′(Sac I/XhoI)-GAGCTCCTCGAGGGGGTCCT ACAGGCTG2GCGT-3′进行全长克隆，获得上述SEQ ID NO：1所示序列的脂肪酶蛋白基因。

由SEQ ID NO：1编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。经实验证实SEQ ID NO：2所示序列的蛋白具有脂肪酶的功能：

将本发明的脂肪酶基因转化大肠杆菌(pET22a/b系列表达载体)，获得高效产生脂肪酶的大肠杆菌菌株。使得其重组蛋白含量达到30％以上。

经测定，发酵液酶活达可达8880U/ml以上，纯化后制得酶活可高达32000U/g的粉状脂肪酶。

利用该酶生产生物柴油应用试验，可使生物柴油含量≥99.5％，总回收率≥95.6％。

所述脂肪酶蛋白命名为铜绿假单胞菌脂肪酶。

在本发明的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括：编码具有铜绿假单胞菌脂肪酶蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.1中从核苷酸第50-985位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.1中从核苷酸第50-985位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.1中从核苷酸第50-985位的核苷酸序列。

在本发明的另一方面，提供了一种分离出的铜绿假单胞菌脂肪酶相关蛋白质多肽，它包括：具有SEQ ID NO.1氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.1序列的多肽。

在本发明还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞，它是原核或真核细胞。在实例中该宿主细胞是大肠杆菌。

在本发明中，DNA是指该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组分分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。