[发明专利]一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因及其应用

权利要求书

1.一种耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，碱基序列为SEQ ID NO.1。

2.根据权利要求1所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.一种如权利要求1或2所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

（1）枯草杆菌CGMCC No1.1628总DNA的提取：将枯草杆菌CGMCC No1.1628单克隆菌落接种至LB培养基中在30-38℃下培养10-15h，提取基因组DNA;

（2）β-甘露聚糖酶重组菌株的构建：根据pET-28a表达载体及β-甘露聚糖酶基因序列特点，进行非融合表达，设计引物：

P1：5’-CGCCATATGCTTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’，

P2：5'-CCGGAATTCTTATTCCGCGATCGGCGTC-3'；

定点突变引物：P3：5’-CGCCATATGG*TTAAAAAGTTAGCAGTGAC-3’， G*为突变碱基，下游引物共用P2；以步骤（1）所得枯草杆菌CGMCC No1.1628基因组DNA为模板，通过PCR技术克隆β-甘露聚糖酶基因；用限制性内切酶Nde I和限制性内切酶EcoR I对β-甘露聚糖酶基因和表达载体pET-28a进行双酶切，然后将酶切后的β-甘露聚糖酶基因和酶切后的表达载体pET-28a连接，获得重组质粒pET-28a-manA和pET-28a-manA*,将重组质粒转化大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)，并筛选阳性克隆，从而获得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*;

（3）β-甘露聚糖酶基因的表达：将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*接种至LB液体培养基中，在35-40℃下振荡培养至 OD_600nm=0.6-1.0，并加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷0.5-2.5 mmol/L诱导β-甘露聚糖酶基因的表达； 

（4）β-甘露聚糖酶酶学活性的检测。

4.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（1）中，将枯草杆菌CGMCC No1.1628单克隆菌落接种至LB培养基中，培养温度为35℃。

5.根据权利要求3或4所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（1）中，将枯草杆菌CGMCC No1.1628单克隆菌落接种至LB培养基中，培养时间为12h。

6.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*接种至LB液体培养基中，培养温度为37℃。

7.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（3）中，将步骤（2）所得β-甘露聚糖酶重组菌株E. coli pET-28a-manA和β-甘露聚糖酶定点突变重组菌株E. coli pET-28a-manA*接种至LB液体培养基中，振荡培养至 OD_600nm=0.8。

8.根据权利要求3所述的耐酸耐高温β-甘露聚糖酶基因在制备耐酸耐高温β-甘露聚糖酶中的应用，其特征在于，步骤（3）中，所加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的浓度为1 mmol/L。