[发明专利]一种检测发热伴血小板减少综合征病毒总抗体ELISA试剂盒的制备和应用

说明书

1.发明领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测发热伴血小板减少综合征病毒总抗体ELISA试剂盒的制备和应用。

2.发明背景

新布尼亚病毒(NovelBunyavirus，SFTS Bunyavirus)，是发热伴血小板减少综合症(Fever with Throbocytopenia Associated Syndrome，SFTS)的病原，为布尼亚病毒科白热病毒属的一种新型病毒，于2009年在中国首先发现，也是中国首例发现的新型病毒。患者出现以高热、血小板减少、白血球降低、多器官功能紊乱、出血等为特征的严重急性传染病，严重影响着人民的健康和生命安全。到目前为止，全国已有河南、江苏、湖北、山东、安徽和辽宁等16个省发现300多病例，造成40余人死亡。国家疾控中心、江苏省疾控中心先后成功的分离到该病病毒，并对其进行了病原学、流行病学、临床医学等研究。目前该病毒序列已经阐明，基于RT-PCR的检测标准已经建立，但是对SFTS的免疫学检测试剂还未完善，使得评价该病毒感染缺乏一个对PCR结果的印证方法，也无法评估群体的既往感染水平以及疫苗的保护作用。

3.发明内容

本发明的目的之一在于提供了一株新的，用于检测发热伴血小板减少综合征病毒的新布尼亚病毒JS-2007-001，该病毒分类命名为新布尼亚病毒(Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus；Novel Bunyaviridae)，其保藏号为CCTCCV201211；保藏时间为2012年3月1日；保藏单位为：中国典型培养物保藏中心；保藏地址为：武汉大学生命科学学院武汉市武昌珞珈山。

本发明的目的之二在于提供了利用上述新布尼亚病毒JS-2007-001制备检测发热伴血小板减少综合征病毒的总抗体EISA试剂盒。

本发明的优点在于，经过适应性培养、免疫原性鉴定和免疫保护作用鉴定发现，本发明中筛选的JS-2007-001病毒毒种具有最佳的生长特性和适应特性，在较短时间内达到生长高峰，可稳定获得较高滴度病毒，免疫动物获得抗体水平较高，从而能开发成为一种稳定的可商业化应用的检测发热伴血小板减少综合征病毒的试剂盒。

本发明公开一种检测新布尼亚病毒NP蛋白(即新布尼亚病毒核蛋白)抗体的ELISA试剂盒的制备和应用，试剂盒包含rNP(核糖核酸蛋白)包被的ELISA反应板、HRP-rNP、四甲基联苯胺(TMB)显色剂。本发明公开采用反转录PCR方法扩增新布尼亚病毒(JS-2007-001病毒株)NP蛋白开放读框序列插入pQE30构建pQE30-NP表达质粒，用pQE30-NP转染M15菌株，常规用IPTG诱导表达6His-NP重组蛋白，Hitrap纯化6His-NP重组蛋白，并包被于ELISA反应板，该基板常规与待测样本孵育可结合样本中的抗NP抗体，后续检测使用HRP-rNP蛋白，用酶底物TMB显色，并用酶标仪分析得出抗体滴度。用于对新布尼病毒的早期和中悦期感染情况的评价。用于人群感染的流行病学观察和疫苗免疫后抗体水平的评价。

进一步，本发明涉及一种用于检测新布尼亚病毒总抗体ELISA试剂盒，所述试剂盒包括如下辅助试剂：rNP蛋白包被的反应板、HRP-rNP蛋白、酶底物四甲基联苯胺(TMB)显色剂；其中所述的rNP蛋白包被的反应板通过如下方法制备：采用SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2作为扩增引物，通过反转录PCR方法扩增保藏号为CCTCC V201211的新布尼亚病毒JS-2007-001的NP蛋白开放读框序列，随后将扩增后的序列插入pQE30构建pQE30-NP表达质粒，随后用pQE30-NP转染M15菌株，再采用常规IPTG诱导表达6His-NP重组蛋白，Hitrap纯化6His-NP重组蛋白，并包被于ELISA反应板。

本发明所述的试剂盒，其对新布尼亚病毒N P特异性抗体最低检出量为5mIU/mL。

本发明还涉及试剂盒在制备用于对新布尼病毒的感染情况进行评估的诊断试剂中的应用。

本发明还涉及所述的试剂盒在制备用于用于人群感染的流行病学观察和疫苗免疫后抗体水平进行评估的诊断试剂中的应用。

本发明所述的制备方法，试剂盒的主要质量指标为：试剂质量指标达到2010版《中国药典》第三部，体外诊断类规程中的要求。其中包括灵敏性、特异性、精密性、稳定性。

以本发明制备的试剂其检测灵敏度为5mIU/mL；特异性验证：与其它同科布尼亚病毒抗体无交叉反应；精密性验证：试剂批间差异(CV％)不高于15％。