[发明专利]一种用基因工程共固定化木聚糖降解酶制备低聚木糖和木糖的方法

权利要求书

1.一种基因工程共固定化木聚糖降解酶制备木糖的方法，其特征是首先制备基因工程共固定化木聚糖降解酶，然后用共固定化木聚糖降解酶水解木聚糖溶液或农林废弃物的汽瀑液，即可得到低聚木糖和木糖。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述基因工程共固定化木聚糖降解酶，由载体和带有在高温下结合力强的高效稳定亲和标签结构的系列木聚糖降解酶组成，其中该高效稳定亲和标签结构与几丁质类载体特异性地结合，从而使系列木聚糖降解酶共固定在载体上。

3.按照权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述的系列木聚糖降解酶是由β-1.4内切木聚糖酶、α-阿拉伯糖苷酶，β-木糖苷酶和α-D-葡萄糖醛酸酶组成。

4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的几丁质类载体，是几丁质、几丁质珠或其他壳质类产品。

5.按照权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于所述的高效稳定亲和标签结构的氨基酸序列为EWASNTYYKIGDLVTYNGITYKCIQAHTSLVGWEPPNVPALWQLQ。

6.按照权利要求1所述的基因工程共固定化木聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤如下：

(1)重组表达载体的构建：

根据标签DNA序列设计上、下游引物，所述的上游和下游引物各含有标签结构一半基因序列，以表达质粒为模板进行反向PCR扩增，得到含有标签序列的DNA扩增产物，通过反向磷酸化、连接、转化，得到带有标签结构的重组质粒；然后克隆出木聚糖降解酶基因，经酶切后分别插至带有标签结构的重组质粒，与亲和标签结构基因进行融合，获得带有木聚糖降解酶和亲和标签结构基因的重组质粒；

(2)重组菌的培养与粗酶制备：

将带有亲和标签的木聚糖降解酶的表达质粒转化宿主，在LB培养基中25～37℃温度培养12-24h，然后将菌液在0-10℃、转速4000-6000rpm条件下离心，用水洗涤沉淀物3次，再用0.02-0.5M pH6.0-8.0的缓冲液重悬，置冰水浴中超声破碎或用高压破碎，破碎后的菌液在0-4℃、10000-13000rpm条件下离心10-30min，取上清，即得带有亲和标签的木聚糖降解酶的粗酶液；

(3)共固定化木聚糖降解酶的制备：

将固定化载体几丁质先进行溶胀或酸解处理，将几丁质与粗酶按照重量比为1∶0.01-0.2溶于pH 4-9的缓冲液中，常温下混合搅拌1h以上，离心去上清，再用缓冲液洗涤至无蛋白检出，获得共固定在几丁质上的木聚糖降解酶，即为基因工程共固定化木聚糖降解酶。

7.按照权利要求6所述的基因工程共固定化木聚糖降解酶的制备方法，其特征在于，步骤(3)中将得带有亲和标签的木聚糖降解酶的粗酶液在60-70℃温度条件下热处理10-20min，以去除大量菌体杂蛋白，获得纯度较高酶液。