[发明专利]抗莱克多巴胺抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于免疫检测技术领域，具体涉及抗莱克多巴胺抗体、以莱克多巴胺-牛血清白蛋白为免疫原制备抗莱克多巴胺抗体的方法和将抗莱克多巴胺抗体应用于莱克多巴胺快速检测试剂。

背景技术

莱克多巴胺是一种人工合成的β肾上腺受体激动剂，属于“瘦肉精”的一种。它可以加快畜禽生长速度，降低酮体脂肪含量，提高瘦肉率。人吃了残留莱克多巴胺的组织后会出现中毒症状，对患高血压、青光眼、糖尿病、前列腺肥大等疾病患者危害更大，严重的可能危及生命。因此，莱克多巴胺快速检测试剂的开发对动物性食品检测以及人类健康具有重要意义。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种抗莱克多巴胺抗体。

本发明的第二个目的是提供以莱克多巴胺-牛血清白蛋白为免疫原制备得到抗莱克多巴胺抗体的过程。

本发明的第三个目的是提供一种莱克多巴胺快速检测试剂，是抗莱克多巴胺抗体的有效应用。

本发明所述的抗莱克多巴胺抗体的制备方法为：用莱克多巴胺人工免疫原免疫小鼠，取小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞融合，由间接ELISA和间接竞争ELISA两种方法结合筛选出对莱克多巴胺有特异性的杂交瘤细胞，从注射杂交瘤细胞的动物腹水中，分离获得所述抗莱克多巴胺的抗体。

所述莱克多巴胺人工免疫抗原为莱克多巴胺-牛血清白蛋白偶联物(Rac-BSA)，是按以下方法自制得到：将莱克多巴胺盐酸盐加入已封闭好的氨基化载体蛋白BSA溶液中，利用碳二亚胺法进行偶联。将合成产物置入pH值为7.4、浓度为10mM(mM为“毫摩尔”，表示浓度)磷酸盐缓冲液4℃搅拌透析2天，每天换液2次，以去除未结合的莱克多巴胺或其它小分子物质，透析后-20℃密闭保存。

筛选抗体用莱克多巴胺-卵清蛋白偶联物同上述方法一样合成。

本发明提供的抗莱克多巴胺抗体可应用于检测莱克多巴胺残留。

本发明还提供一种莱克多巴胺快速检测试剂。其制备方法为：利用胶体金免疫层析的原理，在硝酸纤维素膜上的检测区包被Rac-BSA，对照区包被羊抗鼠多克隆抗体。当待测物中有被测的抗原物质(即莱克多巴胺)时，待测物中的抗原物质就会与标记胶体金的抗莱克多巴胺抗体形成Ag-Ab-Au复合物，该复合物中抗体的活性位点将因被样品溶液中的药物占据而无法与T线上药物抗原结合；所以当样品中的莱克多巴胺含量达5μg/L以上时，检测卡上的T线不显色，可以判定为阳性。反之，当样品中莱克多巴胺含量在5μg/L以下或无残留时，检测卡上的T线显色，判定为阴性。

目前对莱克多巴胺残留检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)、气-质联用法(GC/MS)、放射免疫分析法(RIA)、气相色谱法(GC)、高效薄层色谱法(HPTLC)、液-质联用分析法(LC/MS)、酶联免疫吸附测定法(ELISA)等。由于各种检测方法的不同(包括方法学原理，使用的生物制剂的质量，操作人员的素质及使用设备的好坏等)，所得结果并不能说明某种检测方法的优劣。这些方法准确，灵敏度较高，出现假阳性、假阴性的机率较低，其中RIA、ELISA、TLC等方法可以大批量检测，样品不需要经过处理，但需要特定的设备，操作人员需要技术培训；GC/MS、HPLC等方法的设备更加昂贵，操作人员技术要求更高，且检测量少。上述检测方法都要求在实验室中通过仪器完成，几个小时之后才能给出鉴定结果，不适合现场初筛。莱克多巴胺快速检测试剂具有携带方便，不需要设备，操作人员无需技术培训，可现场操作，3～5分钟即可给出结果等优点，非常适合对大批量样本进行现场筛查的工作。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1

抗莱克多巴胺抗体的制备方法为以下顺序步骤：

1.免疫动物：

选择6周龄，雌性，BALB/C小鼠，将Rac-BSA重氮偶联抗原与福氏完全佐剂等量混合、乳化，经腹部皮下多点注射，进行基础免疫。免疫前断尾取血，分离血清，保存在-20℃，作为正常对照小鼠的血清。隔4周，进行第二次免疫，抗原剂量同基础免疫，抗原与福氏不完全佐剂混合、乳化，对小鼠进行加强免疫。隔4周，进行第三次免疫，免疫条件同第二次。第三次免疫后第7～10天，断尾取血，分离血清，用ELISA方法检测血清效价。用生理盐水稀释免疫原对高效价小鼠进行连续加强免疫。

经过多次免疫剂量的调试试验得出，免疫剂量在50μg/0.2ml/只时为最佳免疫剂量。

2.饲养细胞的制备：