[发明专利]基于多聚半乳糖醛酸酶Pcipg8基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于多聚半乳糖醛酸酶Pcipg8基因开发的检测辣椒疫霉菌的引物及方法。

背景技术

植物病原卵菌是一类重要的植物病原菌，可侵染危害多种植物，导致多种植物毁灭性的病害，如致病疫霉(Phytophthora infestans)、辣椒疫霉(P.capsici)、大豆疫霉(P.sojae)、寄生疫霉(P.parasitic)、樟疫霉(P.cinnamomi)及冬生疫霉(P.hibemalis)分别引起马铃薯、辣椒、大豆、烟草、樟树及柑橘重要疫病，严重年份乃至绝产。卵菌主要以菌丝体或卵孢子在病残体或土壤中度过不良环境并作为初侵染源，在适宜条件下，菌丝体或卵孢子均可萌发产生孢子囊-释放游动孢子，借助雨水或气流传播、侵染而引起植物病害。因此，对该类病菌引起的病害早期进行适时检控，利于控制病害的发生。传统的病害防控策略主要依靠品种、栽培、化防和生态调控等防治措施，这些防控措施主要在病害爆发乃至产生明显危害时实施，忽视了对初侵染源或侵染寄主早期适时采取综合防控和高效治理措施，近而事半功倍，防效甚微，最终很难控制病害的发生与流行。

近年来，PCR技术及其相关分子检测技术已广泛用于植物病原菌消长动态的分子检测与预警，其中利用核糖体rDNA/ITS序列设计特异引物，已针对性的开展了大豆疫霉、致病疫霉、冬生疫霉、寄生疫霉、辣椒疫霉分子检测技术研究，但这些技术性研发成果仅能对病菌活动动态进行检测与预警，但不能对病菌致病特性与发生趋势进行检测与预警。研究表明疫霉菌-寄主互作过程中常分泌多种重要的细胞壁降解酶，主要包括多聚半乳糖醛酸酶(Pg)、果胶甲基酯酶(Pme)、果胶裂解酶(Pel)，这些重要致病因子主要通过降解或软化植物细胞壁的主要成分果胶、中胶层及果胶聚合体，而促使病菌的侵入与定植，对寄主产生寄生与致病性。该类致病酶均由多基因编码，如目前已公开的辣椒疫霉多聚半乳糖醛酸酶基因有Pcipg 2-3(GenBank号分别为：DQ415987，DQ415988)，Pcipg5(GenBank号为：EF558847)。其中少数关键基因是重要的致病靶基因，因此分离鉴定这些重要致病酶的靶标基因，利用基因信息学设计并合成靶标基因的特异引物，针对病菌不同时期致病特性进行分子检测与预警，以便在病菌初侵染期适时采取综合防控措施，减少药剂使用次数及使用量，阻断病菌的扩展与蔓延，控制病害的发生与蔓延。因此，开展重要疫霉菌致病酶类靶标基因克隆及其特异引物设计与合成，研制病菌分子检测、预警技术及其试剂盒，对疫霉病的综合防控具有重要的理论与实践意义。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题是提供一种可特异检测辣椒疫霉的PCR引物对(试剂)。

本发明所提供的特异检测辣椒疫霉的PCR引物对，是多聚半乳糖醛酸酶Pcipg8的特异引物对，其名称为ipg8F-R，由序列表中序列1所示的单链DNA(ipg8F)和序列表中序列2所示的单链DNA(ipg8R)组成。

其中，序列表中的序列1由21个核苷酸组成，序列2由19个核苷酸组成。

含有ipg8F-R的检测或辅助检测辣椒疫霉的PCR试剂盒也属于本发明的保护范围，该试剂盒还可含有DNA聚合酶、dATP、dTTP、dCTP和dGTP等其它PCR试剂。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种检测或辅助检测辣椒疫霉的方法。

本发明所提供的检测或辅助检测辣椒疫霉的方法，包括如下步骤：用ipg8F_R对待测样品进行PCR，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉或确定待测样品中辣椒疫霉菌的含量。

所述待测样品可为土壤或为所述辣椒疫霉的宿主植物的组织和/或器官，如辣椒的叶片、茎、果实等。

上述方法中，可按照如下方法确定待测样品中是否含有辣椒疫霉：以待测样品的基因组DNA或总RNA反转录得到的cDNA为模板，用ipg8F-R进行PCR扩增，检测得到的PCR扩增产物，若所述PCR扩增产物满足下述1)或2)的条件，则所述待测样品含有辣椒疫霉或候选含有辣椒疫霉；若所述PCR扩增产物不满足所述1)或2)的条件，则所述待测样品不含有辣椒疫霉或候选不含有辣椒疫霉；

1)所述PCR扩增产物为176bp的片段；

2)所述PCR扩增产物在琼脂糖凝胶电泳显示为一条100bp-200bp的条带。

其中，确定待测样品中是否含有辣椒疫霉的PCR扩增的条件可为其中，所述PCR扩增的条件可为：95℃预变性3min；94℃变性2min，50℃30s，72℃1min，40个循环。