[发明专利]一种羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中病毒的分子生物学检测方法，具体涉及一种可以对羊口疮病毒进行早期快速诊断的羊口疮病毒实时荧光定量PCR检测试剂盒。

背景技术

羊口疮（Orf），又称为羊传染性脓疱皮炎（contagious ecthyma），是由羊口疮病毒（Orf virus, ORFV）引起的山羊和绵羊的一种急性接触性传染病，以口唇、舌、鼻、乳房等部位形成红斑、丘疹、脓疮、溃疡和结成疣状厚痂为特征。ORFV主要感染山羊和绵羊，也可感染人和其它动物，是一种人畜共患性疾病，世界动物卫生组织规定的法定报告传染病。羊口疮在许多养羊国家分布广泛，在我国北方、西北等养羊较多的地方也较常见，是羊的主要疫病之一。由于病毒的抵抗力强，羊群一旦被感染则不易清除，可持续危害羊群多年，给畜牧业造成较大的经济损失。在羊群中，羊口疮病毒主要感染羔羊和小羊，其病死率比成年羊要高，国内外近年有不少相关的病例报道。而最近也有包括猫、驯鹿、骆驼、鬣羚等动物感染羊口疮病毒的报道，提示羊口疮病毒的宿主范围有所扩大。ORFV初次感染时皮肤损害经过大约6~8周逐渐恢复，留下结痂，而结痂就成为病毒存储场所，并可能污染周围环境。如果出现继发感染，病羊的死亡率会明显上升。

ORFV也能感染人，易感人群为经常接触病羊者，如饲养员、杀羊的屠夫和兽医等。病人通常出现手指，手掌或指关节处的丘疹，有时也会在脸部、嘴唇等其他部位发病。除局部损害外，偶尔也会有发热、乏力、淋巴结肿大等症状。病毒在人与人之间的传播目前还没有报道，但也不能完全排除其可能性。通常，皮肤损害经过4~12周左右逐渐减弱，最后在病变区留下疤痕。一般情况，病人症状都不太严重，并且疾病有很好的自限性。但也有个别免疫功能不全的病例会发生严重的损害。

由于ORFV在世界范围内分布广泛，具有典型的动物传染性，因此成为动物痘病毒里仅次于牛痘病毒的研究最为广泛的病毒。ORFV为双链DNA病毒，属于痘病毒科，脊椎动物痘病毒亚科，副痘病毒属。这个属的其他成员还包括小牛侵蚀性口炎病毒（bovine papular stomatitis virus，BPSV）和伪牛痘病毒（pseudocowpox virus，PCPV）等。ORFV的基因组全长约140kb，编码133个蛋白，大约80%左右的基因位于基因组中心位置相对保守，与其它痘病毒基因高度同源。病毒粒子呈砖形或椭圆形，其表面呈绳索样纵横交错排列结构，颗粒外面有一层膜，该病毒可在牛、绵羊、山羊的肾细胞以及犊牛和羔羊的睾丸细胞内生长，并产生细胞病变。

对于受ORFV感染的动物，目前还没有特效的治疗药物。常用的处理措施是对损伤部位的局部清洗，并使用抗生素控制继发感染。在国内，会使用有去腐生肌、消炎止痛作用的中药辅助治疗羊口疮。而在国外，化疗药物也被用于治疗感染ORFV的人及动物。其中，西多福韦对多种痘病毒具有很强的对抗作用。它能减轻病羊的损伤程度和皮肤损伤持续时间，减少存在于皮肤损伤部位的病毒数量。最近有报道使用西多福韦/硫糖铝混合胶体喷洒药剂治疗感染ORFV的羊羔，但都不能彻底消除ORFV的重复感染现象，并且目前还没有很好的ORFV疫苗能够提供长时间有效的保护。

羊口疮目前还没有国际通用的诊断标准，主要根据典型的临床症状并结合实验室检查来诊断。诊断时需要与口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD）和羊痘（Capripox）区分开来，有时还要与蓝舌病和细菌性疾病进行鉴别。由于缺乏有效的疫苗，症状上鉴别非常困难，因此，对于ORFV的感染防控形势还十分严峻，急需开发一种早期快速诊断羊口疮病毒感染的试剂盒。

目前所采用的实验室诊断，常用的包括PCR、ELISA、电镜，其他的还有组织病理学、免疫荧光、Western blotting、限制性片段长度多态性（RFLP）分析等等。但这些方法存在着一定的不足之处，这些建立起来的方法，相当一部分是针对细胞培养病毒液，很少直接将方法应用于病毒载量较低的临床样本检测，检测灵敏度较低，容易出现假阳性结果。病毒培养并进行病毒的全基因组序列测定，虽可以确定羊口疮病毒感染，但无法为临床诊断及时提供结果，且灵敏度较低。因此卫生部印发的《人感染猪流感预防控制技术指南（试行）》中推荐用实时荧光（Real-time）PCR方法进行检测，由于其方法学上具有简便快速、灵敏度和特异性高的特点，可以实现早期快速诊断。但目前国内外均尚未开发出检测羊口疮病毒实时荧光PCR试剂盒，因此开发该试剂盒成为当务之急。