[发明专利]γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性测定试剂盒及其测定方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物酶领域，尤其涉及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性测定试剂盒及其测定方法。

背景技术

谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS)，又称谷氨酰-L-半胱氨酸连接酶，是谷胱甘肽(GSH)合成过程中的限速酶。细胞内γ-GCS活性升高使GSH合成加速，从而提高细胞内外GSH的浓度。GSH是机体一种重要的抗氧化剂，在保持气道上皮细胞完整性、抵御肺部损伤与炎症和抗氧化损伤等方面起到重要的作用，肺脏具有较高浓度的γ-GCS酶活及GSH浓度(6.1～17.5nmol/mg肺组织)，呼吸道上皮内衬液中GSH的浓度(200～400μmol/l)是血浆中的100倍。所以GSH在呼吸道炎症及过敏反应中起了非常重要的作用，并且对心血管疾病及肿瘤的治疗、愈后有很大研究价值。

测定谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)目前现有的方法有生化比色的速率法(双酶法)、酶联免疫法、高效液相色谱法、放射性同位素法等。国外有关文献介绍了速率法(双酶法)测定谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)，但是只能现用现配，不易长期保存，且价格昂贵。酶联免疫法利用抗原、抗体特异性结合来测定，但其测定出的只是谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的含量，不能测定出酶活力；放射性同位素法中需要用到特殊的仪器设备——液体闪烁计数仪，不易普及；高效液相色谱法同样操作步骤繁琐，且需要昂贵的仪器。

发明内容

为解决现有技术存在的问题，本发明目的是提供一种测定速度快、准确、测定试剂可较长期保存、成本低的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性测定试剂盒。

本发明另一目的是提供一种测定速度快、准确、测定试剂可较长期保存、成本低的γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性测定方法。

本发明所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性测定试剂盒，由如下主要成分组成：

所述缓冲液为pH为6.0～11.0范围内的三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris-HCl)缓冲液、Tris-盐酸/EDTA缓冲液、磷酸盐缓冲液、三乙醇胺缓冲液中的一种。

所述基质液中L-谷氨酸、L-半胱氨酸、氯化镁、AMP体积配比为24∶24∶1∶1。

所述促进剂为L-氨基丁酸、S-甲基-L-半胱氨酸、DL-C-烯丙基甘氨酸、β-氯-L-丙氨酸、L-颉氨酸、L-高半胱氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸中的一种。

所述显色剂中硫酸和钼酸铵的体积比为1∶1，显色剂还可包括邻苯二胺、聚乙烯吡咯烷酮、叠氮钠、乳化剂OP，其与硫酸的体积比都是0.005～0.01∶1。

所述稳定剂在乙二醇、丙二醇、甘油、聚糖、聚醇、硫酸铵或硫酸盐中选择。

所述终止剂在氢氧化钠、焦磷酸钠、三氯乙酸中选择。

一种用所述试剂盒测定γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的方法，其包括如下步骤：

1)将样品依次与缓冲液、基质液、促进剂混合，混合液发生如下反应：

2)反应结束后依次加入终止剂、显色剂发生如下显色反应，得到产物磷钼蓝；

钼酸铵+硫酸+水→钼酸+硫酸铵

钼酸+磷酸根离子→磷钼酸+水

磷钼酸+硫酸氢钠→磷钼蓝

3)反应终产物磷钼蓝在636nm处有最大吸收峰，通过比色测定出吸光度值，再通过标准曲线的回归方程计算出γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性的大小。

优选，步骤(1)反应温度控制在25～37℃范围，反应时间为5～7分钟。

优选，在步骤(2)显色反应结束后还可加入稳定剂。

优选，所述缓冲液、基质液、促进剂、终止剂、显色剂、稳定剂与样品的体积比可分别为：19～21∶1、4～6∶1、0.9～1.1∶1、0.9～1.1∶1、39～41∶1、39～41∶1。

本发明所述γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性测定试剂盒及测定方法，其相比现有技术的有益效果是：

本发明完全利用生化比色方法，利用专一性底物反应，具有灵敏度高、特异性强的特点，测试结果更加精确，不易受到内、外源其他物质的干扰。方法简便，易于操作。反应在缓冲液条件下进行，反应系统更加稳定。另外，本方法不需要特殊、额外的仪器，测试成本低廉。在低成本的情况下可以保证具有较高的测试准确性，便于推广应用。

具体实施方式

下面将以具体实施例来详细说明本发明，在此本发明的示意性实施例以及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1：