[发明专利]苯妥因检测方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及两种苯妥因检测方法，包括苯妥因均相酶免疫测定法与苯妥因酶联免疫吸附测定法。 

背景技术

苯妥因(5，5-Diphenyl-2，4-imidazolidinedione)，其结构式如式(II)所示。 

式(II) 

苯妥因是一种抗癫痫药物、癫痫是一种常见的神经系统疾病，也是我国神经系统疾病中仅次于脑血管疾病的第二大顽症。目前，抗癫痫类药物仍然是控制癫痫发作的主要手段。传统的抗癫痫类药物苯妥因由于治疗窗窄、个体差异大、疗效和毒性反应与血药浓度密切相关，临床医生仅凭经验给药往往达不到有效血药浓度。因此，苯妥因血药浓度的监测对癫痫的诊断和治疗具有重要的临床指导意义。 

利用抗苯妥因特异性抗体建立的免疫检验方法已经运用于病人血液中苯妥 因的跟踪和监测。现有的抗苯妥因特异性抗体都是利用与苯妥因咪唑啉环上其中一个氨基偶联的免疫原而获得的(即苯妥因通过其氨基基团与载体蛋白进行偶联)(美国专利号5306617，美国专利号5747352)。但是通过这种衍生方法制备的抗体使咪唑啉环不能够充分体现其整体免疫性，本发明获得的抗体，以及利用此抗体开发的检测方法特异性强，灵敏度高，能够用于各种样品中苯妥因浓度的检测。 

发明内容

本发明就是为了克服现有技术存在的缺陷，采用苯妥因全新衍生物制备出的特异性抗体的免疫试剂及检测方法弥补了上述这些缺点。 

本发明的目的之一在于提供一种苯妥因的均相酶免疫检测方法(Homogeneous Immunoassay)。 

本发明的再一个目的是提供一种苯妥因的酶联免疫吸附剂检测方法(Enzyme linked Immunosorbent Assay，ELISA)。 

本发明提供的两种苯妥因检测方法操作方便、特异性强、灵敏度高，克服了现有技术存在的检测苯妥因方法特异性不强、灵敏度不高的缺陷。本发明是通过以下技术方案实现的： 

一种苯妥因的均相酶免疫检验方法，使用苯妥因的均相酶免疫检验试剂，该检测试剂由抗苯妥因特异性抗体和苯妥因酶标偶联物组成，包括以下操作步骤： 

(1)采用全自动生化分析仪，将待测样本与苯妥因均相酶免疫检验试剂分别放 入样本仓和试剂仓； 

(2)按照表1进行检测项目参数设置； 

表1 苯妥因均相酶免疫检验参数设置表 

(3)测定OD340nm的吸光值； 

(4)制作标准曲线来定量样本中的苯妥因浓度。 

以上操作(2)步骤还可以通过以下优选方案进行： 

苯妥因均相酶免疫检验参数设置表 

所述抗苯妥因特异性抗体由苯妥因免疫原免疫动物后生产得到。 

所述的苯妥因免疫原，结构式如(I)所示： 

式(I) 

式中，R为连接基团，载体具有免疫原性。 

R可以为-(CH₂)_n-COO-、-O-(CH₂)_n-COO-、-S-(CH₂)_n-COO-或-NH-(CH₂)_n-COO-等，n是1至20之间的整数。优选R为-O-(CH₂)_n-COO-，n值为1至10。更优选R为-O-(CH₂)₄-COO-。 

载体为具有免疫原性的物质，常选用蛋白质。优选为血清蛋白，血蓝蛋白和甲状腺球蛋白。更优选为牛血清蛋白。 

当R为-O-(CH₂)₄-COO-时，该苯妥因免疫原的合成途径和方法如下： 

1.苯妥因衍生物的合成 

(1)用50-200ml有机溶剂A溶解1.0-10.0g的羟基二苯酮和1.0-5.0g的碳酸盐，得到溶液1；将1.0-10.0g的5-溴戊酸乙酯加入到溶液1中，反应完成后用5-20ml的有机溶剂A溶解反应物，经有机溶剂B萃取、干燥、浓缩得到白色固体状化学物3。 

(2)用50-200ml有机溶剂C溶解1.0-10.0g的化学物3，加入强碱溶液反应，得到白色固体；将此白色固体经有机溶剂C萃取、无机酸溶液酸化、干燥、浓缩、纯化等步骤得到白色固体状化学物4。