[发明专利]转基因玉米MIR604及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品种的检测试剂盒及其检测方法，具体涉及转基因玉米MIR604及其衍生品种的LAMP检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

国际农业生物技术应用服务组织近期发表的《2010年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》报告显示，由于转基因作物带来的巨大益处，过去15年内大约有1亿人次的农民做出种植决定。自转基因作物投入商业化种植15年来，全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年，全球29个国家的1540万农民种植了共1.48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了100万公顷。这些国家按照作物种植面积的大小排列分别是：美国（6680万公顷）、巴西（2540万公顷）、阿根廷（2290万公顷）、印度（940万公顷）、加拿大（880万公顷）、中国（350万公顷）、巴拉圭（260万公顷）、巴基斯坦（240万公顷）、南非（220万公顷）和乌拉圭（110万公顷）。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。

转基因玉米作为目前世界上最主要的转基因作物之一，占全世界转基因作物种植面积的30%以上，仅次于转基因大豆。

从世界范围看，转基因玉米的推广已经带来了巨大的社会和经济效益。然而转基因玉米在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性以及对生态环境的安全性方面，包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织（OECO）提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1～5%不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。

转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质（基因表达产物）和是否含有外源基因（DNA）。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用与目的蛋白（抗原）特异性结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthernblot)，PCR检测技术。其中PCR检测方法是最主要，最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，竞争性定量PCR方法，荧光定量PCR方法等等。

目前，国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速灵敏等优点。然而，PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2～3小时，扩增结果的电泳时间需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。所以，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。