[发明专利]猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因、表达载体的构建及其蛋白高效表达的方法

权利要求书

1.一种猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因，其特征在于所述的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.一种包含权利要求1所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因的重组表达载体。

3.如权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体为甲醇调节型重组酵母表达载体，更优选的，所述的重组表达载体为pPIC9K，所述表达载体pPIC9K含有EcoRI和NotI酶切位点，一个强启动子AOX1启动子，一个G418抗性选择位点。

4.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为包含权利要求1所述的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列的宿主细胞，或者为包含权利要求2或3所述的重组载体的包含SEQ ID NO.1所示的核苷酸全部或大于150个核苷酸的部分序列的宿主细胞。

5.如权利要求4所述的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞为真核细胞，更优选的，所述的细胞为甲醇营养型酵母细胞GS115。

6.权利要求1所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因在制备猪圆环病毒II型衣壳蛋白中的应用。

7.一种制备猪圆环病毒II型衣壳蛋白的方法，其特征在于将权利要求1所述的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因克隆至表达载体，然后将得到的重组表达载体转化宿主菌，进行蛋白的诱导表达，收集纯化即得。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)人工合成猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因，所述的基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)将合成的猪圆环病毒II型衣壳蛋白基因克隆到酵母表达载体pPIC9K中，电转化GS 115感受态后，用MD板及G418+YPD平板筛选，激活培养后经甲醇诱导表达并进行无菌检验；

(3)无菌收集菌体，加入适量磷酸缓冲液裂解破壁后制备衣壳蛋白，整个过程中进行蛋白无菌检验；

(4)测定衣壳蛋白的含量及用阳性血清对其进行免疫检测。

9.如权利要求8所述的方法，其特征在于在步骤(1)所述的基因的5’端加入了EcoRI限制性内切酶位点，在其3’端加入了Not I限制性内切酶位点。

10.如权利要求8所述的方法，其特征在于所述的甲醇诱导表达的条件为每间隔24h加入100％甲醇至甲醇终浓度为0.5-1％(v/v)，即加入量为每毫升培养液中加5-10微升甲醇，进行诱导培养，26-30℃250-300转/min震荡培养96～120h，收获菌体，液氮反复冻融3次后超声波破碎制备蛋白。