[发明专利]一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种PCR技术。更具体的说，本发明涉及一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。

背景技术

焦磷酸测序技术是新一代DNA序列分析技术，该技术无须进行电泳，DNA片段也无须进行荧光标记，操作极为简便。焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团(PPi)。PPi可最终转化为可见光信号，并通过光学系统生成一个峰值。每个峰值的高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比，然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成。

焦磷酸测序中所使用的模板需要通过一种称为emPCR的方法制备得到。目前基于焦磷酸测序原理的454高通量测序中的emPCR方法属于常规技术，并且市场上也有开发相对成熟的商品可以直接应用。例如采用罗氏公司推出的试剂盒——RocheGS Titanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2，按其说明书记载的步骤操作，即可制得测序所需的emPCR产物。利用RocheGSTitanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2试剂盒制备测序所用的emPCR产物的步骤如下：

1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备，其中emPCR扩增混合液包括下列各组分：

2)DNA文库捕获；

3)乳化；

4)扩增，扩增反应的程序如下所示：

①94℃，4min；

②94℃，30s；

③60℃，10min；

步骤②至③共50个循环；

④10℃保存；

5)磁珠回收；

6)DNA文库磁珠富集；

7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物。

现有的这种基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法对于所构建的文库中片段大小的要求比较苛刻，如果片段大小差别过大，就会导致emPCR扩增出的磁珠上序列信号强度差异很大，进而影响后续测序时信号的读取效率及准确性，产生较多的冗余数据，使有效数据降低30％以上，同时造成试剂和实验时间的浪费，增加实验成本。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服上述基于焦磷酸原理的454高通量测序中的技术缺陷，提供一种新的用于基于焦磷酸原理的454高通量测序的emPCR方法。

本发明解决上述技术问题所采取的技术方案之一是：一种用于基于焦磷酸原理的454高通量测序中emPCR的方法，其包括如下步骤：

1)乳化油、emPCR扩增混合液和试剂准备；

2)DNA文库捕获；

3)乳化；

4)扩增；

5)磁珠回收；

6)DNA文库磁珠富集；

7)测序引物退火，即制得测序所用的emPCR产物；

其中，步骤1)所述的emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCRAdditive，30.6％～43.0％(v/v)；5×扩增液，18.4％～21.5％(v/v)；扩增引物，2.0％～7.5％(v/v)；emPCR酶混合液，2.6％～5.9％(v/v)；PPiase，0.1％～0.3％(v/v)。上述各组分均为RocheGS Titanium LV emPCR Kit(Lib-L)v2试剂盒自带产品。

较佳的，emPCR扩增混合液包括下列各组分：emPCR Additive，38.4％(v/v)；5×扩增液，20.3％(v/v)；扩增引物，4.8％(v/v)；emPCR酶混合液，5.3％(v/v)；PPiase，0.2％(v/v)；余量为水。

本发明中，所述的水是本领域常规的用于测序的水，优选超纯水。

本发明中，所述的emPCR扩增混合液的总体积是本领域基于焦磷酸原理的454高通量测序中所采用的常规总体积，一般为930μl～980μl，本发明最佳的是937μL。

本发明的一较佳实例为，步骤1)所述的emPCR扩增混合液的总体积为937μL，包括下列各组分：360μLemPCRAdditive；180～200μL5×扩增液；35～55μL扩增引物；50μLemPCR酶混合液；2μLPPiase；其余为水。各组分含量如下表所示：