[发明专利]谷子抗锈基因共分离的分子标记及其检测方法

权利要求书

1.一种谷子抗锈基因共分离的共显性分子标记SNP+InDel/SLAF-75316，其特征在于：其位于基因组Scaffold_8上34638598～34639041之间，在采用如下所示的引物核酸碱基序列进行扩增时，抗锈基因组DNA扩增产物为441bp：

正向引物：5’AGTCGAATTACAGCTCAAATG 3’

反向引物：5’TTACATGATGTGTACTCAAACC 3’。

2.一种检测权利要求1所述的谷子抗锈基因共分离的分子标记SNP+InDel/SLAF-75316的方法，其特征在于：包括谷子基因组DNA的提取、利用SNP+InDel/SLAF-75316标记的引物进行PCR扩增、纯化、测序步骤。

3.一种利用根据权利要求1所述的谷子抗锈基因共分离的分子标记SNP+InDel/SLAF-75316检测谷子抗感材料的方法，其特征在于：包括谷子基因组DNA的提取、利用SNP+InDel/SLAF-75316标记的引物进行PCR扩增、纯化、测序步骤，测序结果为抗锈基因组DNA扩增产物为441bp，而感锈基因组DNA扩增产物为444bp，该标记存在两种多态性形式，具有20个SNP位点、3个插入和6个缺失位点。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中的PCR扩增引物的序列为：

正向引物：5’AGTCGAATTACAGCTCAAATG 3’

反向引物：5’TTACATGATGTGTACTCAAACC 3’。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于其中的DNA提取步骤为： 

（1）将1-1.5 g谷子叶片在预冷研钵中用液氮研磨成粉末；

（2）将粉末转移到1.5 mL离心管中，加入CTAB提取缓冲液650μL（事先在65℃水浴），摇动使粉末均匀分散于提取液中；

（3）65℃水浴40 min，其间颠倒混匀样品3-4次；

（4）冷却至室温后，加入等体积的氯仿︰异戊醇（24:1），轻轻混匀， 4℃ 12 000 rpm离心15 min；

（5）取上清，转入新1.5 mL离心管中，加入等体积的氯仿︰异戊醇（24:1），轻轻混匀，4℃ 12 000 rpm离心15 min；

（6）取上清，转入新1.5 mL离心管中，加入等体积（650μL）-20℃预冷的异丙醇，摇匀，-20℃自由沉淀30 min；

（7）4℃ 12000 rpm离心15 min；

（8）弃上清，75%乙醇清洗沉淀1-2次；

（9）弃75%乙醇， DNA沉淀风干后，溶解于200μL TE（1/10），4℃保存备用，

用0.8%的琼脂糖电泳检测DNA样品质量。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于其中的PCR扩增步骤为：

（1）设计上下游引物：

SNP+InDel/SLAF-75316 F：AGTCGAATTACAGCTCAAATG

SNP+InDel/SLAF-75316 R：TTACATGATGTGTACTCAAACC；

（2）将合成的引物用双蒸水稀释为10 μM，-20℃保存备用；以提取的基因组DNA为模板，按下列反应体系进行PCR：

PCR反应体系（20 μL）为：100 ng 基因组DNA模板、400 μM dNTPs、1×PCR buffer、各0.5 μM上下游引物，1.5 U Taq DNA聚合酶，补纯水至20 μL；

PCR扩增程序为：95℃，4 min；94℃ 30 sec，56℃ 30 sec，72℃ 30 sec，32个循环；72℃，延伸10 min；10℃，冷却10 min，结束反应；

PCR反应在ABI VERITI热循环仪中进行，扩增产物加入指示剂（0.25%溴酚蓝、40%蔗糖水溶液）后用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统拍照后保存。

7.一种利用根据权利要求2所述的方法鉴别抗锈基因纯合基因型和杂合基因型的用途，其特征在于杂合基因型中SNP位点在测序峰图中会出现双峰，Indel位点在测序峰图中显示为其后边峰会出现杂峰。

8.一种利用根据权利要求2所述的方法选育抗锈新品种的用途。