[发明专利]一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白工程技术领域，具体涉及一种基于不同严谨度的用于检测DNA结合蛋白的微孔板核酸杂交ELISA方法。

背景技术

DNA binding protein（全文中统称为“DNA结合蛋白”）是指含有DNA结合结构域，可与单链或双链DNA特异性或普遍结合的一类蛋白。转录因子是序列特异性DNA结合蛋白，含有一个或多个DNA结合结构域（DBDs），可与特异的DNA序列结合进而调控遗传信息的转录表达，控制细胞通过细胞周期，分化以及对外界环境的应答。转录因子是基因表达调控通路及网络的枢纽，许多疾病都与转录因子的异常表达及活化存在密切的关系。因此，有关检测分析转录因子表达及活化程度的方法技术研究一直是生物科学研究的热点和重点。

目前，已经建立多种基于DNA与蛋白质之间的相互作用来检测转录因子表达及活化程度的检测分析方法。最经典的是1981年Garner, M.M.发明的凝胶迁移阻滞实验，即EMSA（Electrophoresis Mobility Shift Assay）。该技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温，在非变性的聚丙烯凝胶电泳上，分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢，以此来反映转录因子表达及活化程度。这一技术目前仍非常有效地用于转录因子蛋白检测分析，但存在放射性标记对实验人员及环境危害的缺陷。因此后来发展了一系列对此技术进行非放射性标记的改进。DNase印迹法(Galas, D.J., 1978)，外切核酸酶法(Wang. J.K,2006 )以及最近发展起来的染色质免疫共沉淀芯片(Bulyk, M.L, 2006; Zhu, C., etal., 2009; Viggiani, C.J., 2009)，蛋白质结合微阵列(Bulyk, M.L, 2006)和电化学方法(Boon,E.M., 2002)等等也是近年来发展起来的检测转录因子表达及活化程度的方法，但是这些方法都有一定的缺陷，如步骤复杂，耗时，需要相应的仪器，需要特异性抗体等等。

转录因子和DNA之间的相互作用一直是科研工作者关注的对象。鉴于这些技术目前仍然存在的缺点，发展一种既不需要针对转录因子的特异性抗体又不需要放射性标记或核酸酶的转录因子的检测方法具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于根据现有检测转录因子表达和活化水平的检测技术中存在的问题和不足，提供一种基于不同严谨度杂交的DNA结合蛋白的ELISA检测方法，它主要通过DNA binding protein在低严谨杂交条件下能增强双链DNA 结合的稳定性，因而在高严谨洗脱条件下能够稳定的以双链形式存在而不被洗脱的原理，配合HRP显色，用来检测DNA binding protein。

本发明提供了一种检测DNA binding protein表达和活化水平的新方法。所述的基于不同严谨度杂交的DNA binding protein的ELISA检测方法，包括单链核酸分子包被微孔板的制备和运用制备的微孔板检测转录因子蛋白。

核酸分子包被微孔板的技术关键是如何将核酸分子牢固地连接固定到微孔板内，使固定的核酸分子既保持与液相中DNA binding protein的结合活性，又能够经受频繁的洗涤而不致脱落。为了使固定的核酸分子具有与液相中转录因子蛋白结合的活性，要求用于固定的核酸分子具有足够的长度，特别是核酸分子上所嵌合的转录因子蛋白结合序列，要与微孔板表面间存在充分的距离，避免微孔板表面对核酸分子与蛋白质的结合反应造成空间障碍。用于与微孔板表面连接的核酸分子的一端应连接较长的手臂分子（arm，linker, spacer molecules）,如C12、PEG（Hexaethylene glycol）等。微孔板表面固定的核酸分子密度要适宜，避免过密的核酸分子造成蛋白质结合的空间障碍。在微孔板内包被核酸分子过程中，要注意洗涤以除去那些未吸附到微孔板的核酸分子，还要注意进行封闭，避免造成非特异性结合的假阳性结果。