[发明专利]一种高品质超低分子量肝素的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种制备高品质超低分子量肝素的方法。

背景技术

肝素（普通肝素即未分级肝素）是一种高度硫酸化的糖胺聚糖，在体内和体外都有抗凝血作用。在临床上主要用于血液透析、血栓栓塞性疾病、心血管手术、心脏导管检查、体外循环等。其最大的副作用是引起出血，有时甚至会导致出血性死亡，据统计其出血的发生率高达35%。尽管如此，它仍是防止血栓形成、肺栓塞、弥漫性血管内凝血以及某些血栓栓赛性并发症的首选药物。虽然人们采取各种方法，比如减小剂量、局部用药等以降低出血危险，但是都无法从根本上解决问题。肝素的抗凝血活性分为抗栓活性(FXa)和抗凝(FIIa)活性两大类，在抗血栓形成的过程中，抗FXa活性与抗FIIa活性的作用都是必需的，抗血栓作用的衡量标准用抗FXa／FIIa值表示，其值越大，表示抗血栓作用越强，出血倾向越小。低分子肝素是由未分级肝素经化学降解或酶降解方法制备的钠盐或钙盐，是普通肝素的一种升级产品，其平均分子量约为5000 Da。当皮下注射低分子肝素时，其在体内的抗FXa的作用要比普通肝素强得多，而抗FIIa活性较弱，还具有体内半衰期延长、生物利用度高等优点，是目前主流的抗血栓类的药物。虽然低分子肝素的抗FIIa活性与未分级肝素相比相对较弱，但是它依然会有一定几率引起出血以及血小板减少症。

超低分子量肝素是经降解而成的肝素寡糖片段，其主要双糖结构与肝素基本相同，即α-L-IdoA-2-SO₄-β(I→4)-α-D-GIrNSO₃-6-SO₄，平均分子量约为2200 Da，而且分子量的分布区间比低分子肝素更加集中。它与低分子肝素产品相比，有着更好的抗血栓活性，更小的出血危险，以及更低的对血小板的影响。对超低分子肝素的研究与开发已受到越来越多的关注，已逐渐成为国内外肝素研究的热点。目前已经证实，在多种转移性或局部进展性实体瘤患者中预防性使用超低分子量肝素后，静脉血栓栓塞事件的发生率大幅降低。我国现有公开号为CN101671711A的发明专利“一种制备超低分子量肝素的方法”和公开号为CN102040671A的发明专利“一种超低分子量肝素的制备及纯化工艺”。其中“一种制备超低分子量肝素的方法”是用麦芽糖结合蛋白-肝素酶I融合蛋白降解底物中肝素，得到超低分子量肝素；“一种超低分子量肝素的制备及纯化工艺”是以β-消除降解法为基础，肝素与有机季铵盐作用生成的肝素季铵盐亲和取代后生成的肝素苄基酯，碱性条件下降解得到低分子量的肝素片段，通过无机陶瓷超滤与中空纤维超滤结合的方法进行分离纯化，获得分子量分布范围在2000~2500D、平均分子量为2200 Da的超低分子量肝素钠（钙）。其中，以酶降解从肝素钠提取超低分子肝素的工艺存在着反应条件苛刻、成本过高、杂质过多、产品难以纯化等缺点。而采用β-消除降解法制备的超低分子肝素也有着抗FXa因子效价过低、抗FIIa效价过高、会有一定几率导致出血等问题，主要是由于样品纯度不够、杂质含量过多、小分子肝素聚积等因素导致，这些都是目前的提取工艺所不能解决的问题。

发明内容

本发明所要解决的技术问题就是针对现有技术的不足，提供一种高品质超低分子量肝素的低成本制备方法。

本发明应用类似于化学合成肝素五糖的作用原理，针对猪肠黏膜来源的肝素，以改良的β-消除降解法为基础，创新性地采用重盐化、磷腈碱解聚、皂化等方法解决了料液中的大分子肝素过多、小分子肝素聚积等关键问题，从而制备得到超小分子片段。通过此种方法制备得到的超低分子肝素钠平均分子量为2000～3000，分子量分布：＜1600的比例≤40.0%；＞4500的比例≤11.0%；抗FXa/FIIa＞30，抗FXa效价：145-180 IU/mg，抗FIIa效价：＜5.0 IU/mg。与低分子肝素钠和超低分子肝素钠相比，本发明制备的高品质超低分子量肝素钠有着非常好的的抗血栓活性，更小的出血危险，以及更低的对血小板的影响，有望成为新生代的肝素类抗血栓药物。

为实现本发明目的，本发明的超低分子量肝素制备方法包括以下步骤：

1、肝素-苯索氯铵盐的合成：按1：2~3的重量比称取肝素钠和苯索氯铵盐，分别溶于蒸馏水中，将在肝素钠溶液缓慢加入到苯索氯铵盐溶液中，搅拌2小时以上，静置分层，去上清，并将剩余悬浮物离心，收集沉淀物肝素-苯索氯铵盐，然后洗涤并干燥；

2、肝素苄基酯的合成：将（1）所得肝素-苯索氯铵盐溶于二甲基甲酰胺，然后加入氯化苄，于55~60℃下进行酯化反应25~30小时；