[发明专利]一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量

权利要求书

1.一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应定量检测汉滩病毒载量的方法，其特征在于，该方法利用汉滩病毒定量检测标准品，通过检测病毒基因序列引物及探针的设计及方法的选择，建立一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法，来定量检测肾综合征出血热患者血浆或其他体液及组织的汉滩病毒载量。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的汉滩病毒定量检测标准品是：用含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒，体外转录获得76-118株S片段RNA，并通过紫外分光光度计对其准确定量，依据其分子量计算出单位体积内的摩尔浓度作为标准品。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的引物及探针的设计是：在对汉滩病毒标准株及中国流行代表株A16及84Fli的S片段的序列比较分析的基础上，采用Primer 5.0进行引物及探针的设计，引物对间距离为200bp长度以及引物与探针完全与目的片段互补，反转录引物选择随机六聚物，其中：

上游引物为：5’-TACAGAGGGAAATCAATGCC-3’；

下游引物为：5’-TGTTCAACTCATCTGGATCCTT-3’；

探针为：5’-(FAM)ATCCCTCACCTTCTGCCTGGCTATC(TAMRA)-3’。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的一步法荧光探针实时定量逆转录聚合酶链式反应方法是：以定量的体外转录RNA为标准品，调整至合适的浓度后，1∶10倍比稀释10个梯度作为标准曲线，无RNA酶水为阴性对照，含汉滩病毒标准株76-118S片段质粒为阳性对照，患者RNA提取标本为样本，PCR检测反应总体积为25μl，反应体系含样本3μl，一步法酶混合物0.5μl，2×缓冲液12.5μl，浓度为200nmol/L的反转录随机引物及定量片段的上下游引物，100nmol/L探针，无RNA酶水补齐到25μl；real time PCR反应在实时荧光定量PCR仪上进行，循环条件为：42℃：15min，95℃：2min，然后95℃：15s，53℃：30s，72℃：30s，共50个循环，每次循环的72℃延伸阶段由仪器读取荧光值，并自动计算分析得到标准品和样品的扩增曲线和Ct值及单位体积样本的病毒拷贝数。

5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的汉滩病毒定量检测标准品按如下步骤制备：

(1)PCDNA3.0-76-118S质粒线性化：

PCDNA3.0-76-118S质粒20μl(约含10μg)，缓冲液5μl，BglII2.5μl，去离子水22.5μl，反应条件37℃，2h；

(2)纯化酶切产物并定量：

酶切产物加入50μl无RNA酶水，100μl的苯酚、氯仿和异戊醇的混合物，其中苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1；13000rpm室温离心15min，吸取上清水相至新离心管，加入100μl氯仿，13000rpm室温离心5min，吸取上清水相至新离心管，加入2.5倍体积的无水乙醇，-80℃放置2h，然后以13000rpm、4℃，离心15min，弃上清，加入500μl的质量分数为70％的乙醇，13000rpm，4℃，离心15min，弃上清，室温干燥后加入50μl无RNA酶水重悬，1∶50稀释纯化后样本，紫外分光光度计260nm波长检测DNA含量；

(3)76-118S片段体外转录：

缓冲液25μl，线性化质粒20μl，T7启动子体外转录酶5μl，37℃作用1h；

(4)体外转录产物DNA酶去除与纯化：

加入无RNA酶的DNA酶，1U/μg DNA，37℃作用15min，加入等体积苯酚、氯仿和异戊醇混合物，其中，苯酚∶氯仿∶异戊醇＝125∶24∶1，混悬1min，微量离心机13000rpm离心2min，吸取上层水相到另一个离心管，加等体积氯仿和异戊醇混合物，其中，氯仿∶异戊醇＝24∶1，混悬1min，微量离心机13000rpm离心2min，吸取上层水相到另一个离心管，短暂离心10s，吸取底层相弃去，加0.1体积3M乙酸钠和等体积异戊醇/2.5倍体积无水乙醇，混匀冰上放置5min，13000rpm离心10min，小心倒掉上清，用1mL 70％乙醇洗涤，13000rpm离心2min，倒掉上清，风干沉淀，20μl无RNA酶水重悬，-80℃保存；

(5)体外转录的RNA定量：

1∶100稀释体外转录RNA样本，紫外分光光度计260nm波长检测RNA含量，依据检测的RNA含量计算每ml体外转录产物RNA样本的拷贝数，公式为：

copies/mL＝6.02×10²³×10^-3×C/MW；

式中，C为浓度，MW表示体外转录RNA产物的分子量，即碱基数×3.45×10²。