[发明专利]麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物在制药中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及抗癌药物的制备，尤其涉及一种麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物在制备抗肝癌药物中的应用。

背景技术

高寒藏药麻花艽系龙胆科(Gentianaceae)、龙胆属(Gentiana)，主要分布于西藏、青海、甘肃海拔2500-4700米的高寒地区，多年生草本，全草及根入药，由于其分布散，生长期长，药材收集极为困难，因而已成为濒危物种。主治黄胆性肝炎，风湿关节痛、结核病潮热、哮喘、抽搐、休克、过敏反应。富含五环三萜类次生代谢物，β-amyrin(β-香树素)是其中的一类重要的三萜类化合物。

β-amyrin是植物中最常见的三萜类化合物之一。它的五碳环骨架，折叠为椅式构象，是由2，3-氧化角鲨烯经过一系列反应在β-amyrin合成酶催化下形成的。而其合成酶是该途径中非常重要的限速酶，控制着这些药用成分前体合成的第一步反应，因此对该基因的克隆具有极其重要的意义。齐墩果酸是该反应中的最终产物，在龙胆科植物麻花艽中β-amyrin合成酶基因对于抗肝炎有效成分齐墩果酸的积累具有很高的促进作用。

到现在为止，已从许多双子叶植物中分离到了β-amyrin合成酶基因，如双子叶人参中的PNY1，PNY2；干草中的GgbAS1；豌豆中的PSY；还有截形苜蓿和白桦等：单子叶植物燕麦中的AsbAS1。并有文章报道对其功能的验证。尽管麻花艽中β-amyrin合成酶基因GsAS的克隆和功能验证已有报道，但是，利用麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物制备抗肝癌药物还未见报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明要解决的问题是提供一种麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物在制备抗肝癌药物中的应用。

本发明所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物在制备抗肝癌药物中的应用，其中：所述肝癌细胞是HepG2肝癌细胞或SMMC7721肝癌细胞；有效抑制HepG2肝癌细胞或SMMC7721肝癌细胞生长的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物浓度为1～25μg/mL，优选浓度为10μg/mL。

本发明提供的麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物为研制开发抗肝癌药物奠定了基础。

为了更好地理解本发明的实质，下面用麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物药理实验及结果来说明其在抗肝癌药物制备中的应用。

本发明所述麻花艽β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物的制备：

利用麻花艽cDNA为模板，克隆得到β-amyrin合成酶基因GsAS，构建酵母表达载体pPICZA-GsAS，转化酵母，酵母转化后会形成甲醇诱导型(Mut⁺)和甲醇敏感型(Mut^s)菌株，在MM培养基上生长而在MD培养基上不生长的菌株为Mut^s型酵母菌株，而在两种培养基上都能生长的为Mut⁺型酵母菌株。对比pPICZA-GsAS酵母转化子在含MM(含甲醇培养基)和MD(无甲醇培养基)培养基上的生长情况，筛选出Mut⁺酵母转化子。挑选Mut⁺酵母菌于25mL MGY培养基中28℃振荡培养至OD₆₀₀＝2-6，转接到100-200mL MM培养基中，使其OD₆₀₀＝1.0。继续28℃振荡培养，每24小时加一次甲醇(终浓度0.5％)，震荡培养4d，收集菌体备用。

取甲醇诱导4天的酵母溶液加入50mL的离心管中，离心菌体，用液氮研磨菌体；加入3-4mL体积比为2∶1的甲醇-氯仿(色谱纯)，超声波破壁30min；10000rpm，离心，上清液用氯仿萃取，并用水洗，重复操作。收集氯仿层溶液，水浴蒸馏浓缩，回收溶剂得浸膏。

β-amyrin合成酶基因GsAS的酵母表达产物的药理实验：

正常组：10％小牛血清的DMEM培养基培养上指数期正常贴壁生长的HepG2肝癌细胞或SMMC7721肝癌细胞；对照组：用溶剂甲醇作对照；实验组：浸膏用甲醇溶解，用于处理HepG2肝癌细胞或SMMC7721肝癌细胞的浓度为0.5，1，5，10，25，50，75，100μg/mL。